Замена сайлентблоков передних рычагов цена в Москве и Санкт-Петербурге

Сайлентблоки, установленные на передних рычагах подвески автомашины, гасят сильные колебания и противостоят деформациям. Конструктивно этот технический элемент представляет собой две втулки, между ними располагается резиновая вставка, обычно выполненная из полиуретана. Вставка больше всего подвержена износу. Основная функция механизма: соединять части подвески, иногда он служит для крепления коробки передач или амортизаторов.

Этапы проведения ремонта

Понять, что эта деталь машины износилась, можно по нестабильному поведению автомобиля на дороге, его начинает бросать из стороны в сторону. Неравномерный видимый износ покрышек также свидетельствует о проблеме. Перечисленные сигналы требуют посещения автосервиса и замены этой детали.

1. Мастера точно устанавливают проблему, демонтируя колеса.
2. Приступают к демонтажу и замене сайлентблока передних рычагов: откручивают болт, расположенный на переднем рычаге, а также крепежную гайку на заднем сайлентблоке.
3. Тянут на себя стойку вместе рычагом, откручивают болты, которые крепят его к шаровой опоре: снимают деталь.
4. Выпрессовывают задний сайлентблок.
5. Приступают к монтажу нового механизма, строго придерживаясь обратной последовательности, по окончании работ не забывают восстановить развал-схождение колес.

Иногда ремонт проводят с помощью устройств для установки сайлентблоков, но часто обходятся ключами и кувалдой.

Сотрудничайте с профессиональным автосервисом

Замена этой необходимой детали не представляет особенных сложностей. Однако если водитель не обладает навыками механика, лучше доверить эту работу профессионалам. Таким образом удастся обеспечить полную безопасность передвижения на транспортном средстве и его длительную работоспособность.

Производители гарантируют продолжительность работы сайлентблока на 100 тыс. километров, но учитывая состояние дорог, эксперты советуют проверить техническое состояние подвески через 50 тыс. километров пробега. Выход из строя сайлентблока сигнализирует о серьезной поломке, требующей ремонта.

Запрессовка сайлентблоков рычага ВАЗ своими руками + Видео

Многорычажная подвеска автомобиля стала уже повседневностью. Сейчас практически все автомобили оборудованы данной подвесной системой. Ведь она обеспечивает неплохую мягкость и устойчивость автомобиля на дороге, которая требуется на любом типе транспорта. Мало кто знает, но не менее главным элементом такой подвески является сайлентблок. В этой статье мы расскажем, что это такое, как происходит запрессовка сайлентблоков рычага ВАЗ и какое приспособление при этом используется?    

 Что такое сайлентблок?

Сайлентблоком называют специальную деталь, которая предназначена для мягкого крепления элементов подвески, в частности рычагов к передней или задней балке автомобиля. Такая деталь представляет собой резиновый цилиндр закругленной формы, внутри которого устанавливается металлическая втулка. Вся эта конструкция установлена в толстом отверстии рычага, внутрь которое вставляется специальный болт, предназначенный для крепления к передней или задней балке автомобиля.

Сайлентблоком называются только детали, крепящие рычаги автомобиля, однако с похожими функциями и конструкцией имеются и другие втулки, которые также предназначены для крепления других элементов подвески, таких как, амортизаторы и реактивные тяги.

Суть работы любого сайлентблока заключается в гашении вибраций, возникающих при перегибе или ударах рычагов. Таким образом, продлевается срок службы мест соединений двух важных деталей и обеспечивается более мягкое преодоление препятствий.

Как и любая деталь подвески, сайлентблок тоже подвергается естественному износу и нуждается в замене, об этом подробнее в статье Как поменять сайлентблоки задних и передних рычагов своими руками. Ускоренный выход из строя блоков может предвещать и агрессивная езда. В нее входит быстрое перемещение по лесу на автомобиле, а также всевозможные прыжки или резкие скачки. Дело в том, что резина – это мягкий материал, который обеспечивает хорошую вибропоглощаемость, но совершенно не имеет достаточной прочности и долговечности, именно поэтому, их необходимо менять при первых же признаках – «скрип в районе передней подвески автомобиля».

Видео — Замена сайлентблоков переднего рычага ВАЗ

Запрессовка сайлентблоков

Такая деталь, как рычаг, требует достаточно надежного крепления, так как обеспечивает полную поддержку автомобиля в целом. Чтобы выдерживать такие нагрузки, сайлентблоки не закрепляют при помощи обычного соединения. Для этого их запрессовывают с помощью различных приспособлений и инструментов.  

Во время установки сайлентблоков их в обязательном порядке нужно смазать. Дело в том, что рычаг имеет большую жесткость, что может повредить втулку в процессе монтажа. Смазывающее вещество должно быть густым. В роли него может выступать: литол, солидол и другие.

Самым простым инструментом для запрессовки считается обычный молоток. Для этого, втулку вставляют насколько это возможно в рычаг, а поверх сайлентблока устанавливают цилиндрическую обойму, чтобы не повредить изделие. Легкими ударами молотка сайлентблок запрессовывается в рычаг и после этого, деталь устанавливают на автомобиль.

Другим вариантом запрессовки пользуется основная масса автомобильных мастеров. Он подразумевает в себе использование самых обычных гаражных тисок. Рычаг вместе с обоймой и сайлентблоком вставляется в диски и постепенным сжиманием входит в отверстие рычага. Конечно, способ с использованием тисок более надежен, так как ударами молотка можно запросто собрать узел неправильно, потому как во время ударов, изделие смещается и входит не центровано. Тиски же, в свою очередь позволяют полностью контролировать весь процесс и вносить определенные коррективы во время запрессовки сайлентблока.

Последний способ скорее напоминает дорожный вариант ремонта, так как пользуются им очень редко. Под автомобиль устанавливаются две доски, между которыми помещается шарнир и рычаг, а второй конец рычага направляется вверх, то есть к порогу автомобиля. Домкрат медленно опускают, и под весом автомобиля сайлентблок спокойно и ровно запрессуется в рычаг.

Несмотря на всю простоту и доступность методов, рекомендуется все же, использование специальных устройств, которые легко справятся со своей задачей и не повредят новые изделия. Применение всевозможных методов зависит от конструкции самого шарнира, если его форма имеет более сложные контуры, то для запрессовки лучше всего пользоваться специальным прессом.

Приспособление для запрессовки сайлентблоков

Помимо самых простых методов запрессовки, которыми пользуются, в основном, самые обычные автолюбители, существует и другой метод. Он подразумевает использование специального приспособления, которое предназначено исключительно для запрессовки сайлентблоков.

Такое приспособление представляет собой специальный съемник с медленно опускающимся прижимом. На конце съемника установлен специальный паз, выполненный точно под форму шарнира. Рычаг вместе с втулкой помещается на этот конец, а сверху начинает вкручиваться специальный болт. На конце болта находится специальный прижим, который сжимает две детали и сайлентблок точно встает на свое место.

Другие устройства помимо запрессовки шарнира могут выполнять и функцию съемника. Они же, в свою очередь, имеют другую более сложную конструкцию с подобным принципом действия. Благодаря своим свойствам, такое приспособление поможет избежать дополнительных затрат и становится универсальным.

Вот так можно запрессовать сайлентблок в рычаг автомобиля. Стоит напомнить, что данная процедура выполняется только на разобранной подвеске. Ведь, чтобы выдавить старый и установить новый сайлентблок, необходимо вначале снять рычаг с автомобиля. Тем не менее, в интернете полно инструкций и на эту тему, а это значит, что все работы по запрессовке сайлентблоков с дальнейшей установкой рычага на автомобиль, вы в силах выполнить самостоятельно. Это поможет вам сэкономить довольно большие деньги на услугах мастеров автосервиса и даст самый колоссальный опыт в ремонте и обслуживании автомобиля. 

Замена сайлентблоков в автосервисе «Сакура-Моторс»

Состояние подвески автомобиля напрямую влияет на то, как ваш автомобиль ведет себя на дороге и комфортно ли им управлять во время движения. Следует отметить, что на один из элементов подвески, который называется сайлентблок, приходится наиболее мощная нагрузка среди всех частей подвески, ведь помимо колебаний именно эта деталь должна гасить все деформирующие движения.

Сайлентблоки представляют собой крепежный элемент и предназначены для снижения жесткости соединения деталей подвески между собой. Данная деталь, выполняется из пары металлических втулок, между которыми расположена резиновая или полиуретановая вставка, поэтому сайлентблоки могут быть резиновые или полиуретановые.

Сайлентблоки подвержены наибольшему износу, и поэтому примерно каждые 50 000 пробега необходимо проводить их ревизию и своевременно производить замену.

Автосервис «Сакура-Моторс» предлагает качественную диагностику деталей подвески. Наш опыт позволяет осуществлять качественную замену сайлентблоков подвески в кратчайшие сроки по доступной цене. В наши услуги входит полная диагностика и замена изношенной детали. Все работы мы производим только профессиональным инструментом, что позволяет нам соблюдать все регламенты обслуживания вашего автомобиля согласно стандартам завода-изготовителя.

Стоимость замены сайлентблоков.

Цена замены сайлентблоков задней или передней подвески зависит от особенностей конструкции и модели авто, и начинается от 350 р. без учета демонтажа детали.

Причина износа и поломки сайлентблоков.

Сайлентблоки, как и любой другой элемент в автомобиле подвержены временному износу. Помимо этого на их состояние будет влиять и стиль вождения, качество дорог и негативные погодные условия.

Полный износ сайлентблоков помимо ускоренного истирания колес и снижения комфорта езды чреват более глобальными проблемами. Например, металлические части шарниров со временем разбивают посадочные места, из-за чего при ремонте ходовой придется позаботиться уже о замене не только сайлентблоков, но и целого ряда других деталей, так как подобные проблемы восстановлением чаще всего не устраняются.

Чтобы определить, что шарниры сайлентблоков пришли в негодность, стоит запомнить несколько признаков, которые намекают на их неисправность:

• ухудшается качество устойчивости автомобиля на дороге, его начинает «водить» из стороны в сторону;
• усиливается шум и вибрация при движении, стук в подвеске;
• начинает появляться характерный повышенный износ шин, когда более активно стираются бока колес.

Как минимум одного из вышеизложенных признаков достаточно, чтобы посетить наш автосервис.

Замена сайлентблоков.

Замена сайлентблоков довольно трудоемкая работа, которая требует от специалиста определенных знаний и умений. Особенно важно правильно запрессовать резинометаллические шарниры. Поэтому если работы по замене сайлентблоков будут выполнены некачественно, это может привести к серьезным проблемам в будущем.

Этапы работ по замене сайлентблока:

• демонтаж колеса в том месте, где требуется замена шарнира. Зачистка креплений;
• демонтаж рычага подвески;
• снятие рычага с последующим выдавливанием и заменой сайлентблока;
• установка нового шарнира и рычага подвески;

Выполнение всех этих работ в автосервисе «Сакура-Моторс» занимает минимальное количество времени. А высококачественные комплектующие, используемые в работе, позволяют добиться высокого результата.

Внимание. Информация носит справочный характер и не является публичной офертой.

Замена сайлентблоков в Москве в автосервисе Гарантия в ЮЗАО

Одним из важных крепежных элементов автомобиля является сайлентблок. Эти резинометаллические шарниры устанавливаются в нескольких узлах. В процессе эксплуатации машины износ изделий неизбежен, их замена должна проводиться своевременно. Повреждение крепежных элементов делает езду небезопасной, возникает риск появления серьезных деформаций, поломок. Профессиональная замена сайлентблоков в Москве осуществляется в автосервисе «Гарантия» на Каховке 28.

Необходимость замены сайлентблоков

Данные крепежные элементы устанавливаются в передней и задней подвесках, они используются для фиксации коробки передач, амортизаторов, мотора. В их функции входит гашение колебаний, предотвращение деформаций, обеспечение правильного положения деталям узлов.

На элементы падает высокая нагрузка, что и приводит к естественному износу. Согласно инструкции, замена сайлентблоков должна производиться через каждые 100 тысяч километров пробега. Но специалисты рекомендуют учитывать особенности дорог в Москве, заменять эти элементы чаще, каждые 50 тысяч километров пробега.

Есть несколько признаков, по которым можно определить износ крепежей. Заменить их необходимо, если:

• усложнилось управление автомобилем, реакция на поворот рулевого колеса происходит с задержкой;
• на скорости машину бросает в стороны;
• нарушился развал схождение;
• неравномерно изнашиваются покрышки.

Оценить состояние этих деталей можно посредством осмотра. Автомобиль нужно установить на яму, эстакаду, очистить конструкции от грязи. На элементах не должно быть разрывов, трещин.

Медлить с установкой новых крепежей нельзя, это приведет к разрушению других деталей, потребуется менять весь узел, что потребует существенных затрат. К тому же езда на автомобиле с изношенными изделиями небезопасна, возникает реальный риск аварии.

Не каждый владелец машины знает, как должен выглядеть качественный, неповрежденный крепеж, может выполнить его установку. Поэтому большинство водителей в Москве предпочитают доверять диагностику и установку элементов профессиональным мастерам. В услуги автосервиса «Гарантия» входит демонтаж и установка этих важных деталей. Стоит процедура недорого, она доступна для каждого автовладельца в Москве.

Преимущества замены сайлентблоков в автосервисе Москвы

Основной сложностью в установке новых крепежных изделий является запрессовка. Для того чтобы правильно провести монтаж, исключить риск повреждения, требуется:

• знание устройства узла;
• специальные инструменты;
• пресс для выпрессовки и запрессовки.

Производственные помещения нашего автосервиса в Москве отлично оснащены. В арсенале мастеров имеются все необходимые инструменты, оборудования для замены сайлентблоков. Наши специалисты имеют квалификацию, опыт, оперативно, качественно проводят демонтаж изношенных деталей и установку новых крепежей. В наличие на складе всегда имеются изделия из резины и полиуретана для всех типов подвесок.

Одновременно с заменой сайлентблоков в автосервисе проводится диагностика амортизаторов, подвески. При необходимости выполняется ремонт, установка новых деталей. Это позволяет своевременно устранить имеющиеся неполадки, предотвратить появление серьезных неисправностей.

В нашем автосервисе в Москве проводится текущий и капитальный ремонт автомобилей, иномарок и отечественных моделей. Мы предлагаем широкий спектр услуг, компьютерную диагностику. У нас действуют умеренные расценки, доступные для всех автовладельцев.

Замена сайлентблоков подрамника ниссан

Сайлентблок или резинометаллический шарнир — деталь машин и механизмов, разновидность шарнира, в котором подвижность обеспечивается за счёт эластичности резины, без трения, что позволяет устранить операции обслуживания и смазывания, увеличить срок службы узла, а также снизить уровень передаваемых через шарнир вибраций.   Сайлентблоки гасят или изолируют радиальные, осевые, торсионные и карданные колебания. Сайлентблок представляет две металлические втулки, между которыми имеется резиновая вставка. Они служат для соединения деталей подвески и за счет упругой вставки между втулками (резина или полиуретан) гасит колебания, передаваемые от одного узла к другому. Сайлентблоки встречаются как в передней подвеске автомобиля, для крепления рычагов, стабилизатора поперечной устойчивости, так и для соединений в задней подвеске. Также они применяются для крепления коробки передач и двигателя.

Подрамник — выполняет сразу несколько функций. Прежде всего подрамник и опора подвесок, которая устанавливается в передней части машины, защищает силовой агрегат от ударов снизу. Подрамник может устанавливаться на раму, а в безрамных автомобилях может устанавливаться отдельно, частично выполняя функции рамы. В некоторых автомобилях, может не оказаться ни рамы, ни подрамника, тогда усиливающими элементами конструкции будут выступать лонжероны. Именно к подрамнику, а не к кузову, крепятся рычаги подвески, штанги стабилизатора поперечной устойчивости, опора двигателя и рулевого механизма. Кроме того подрамник соединяет между собой элементы подвески. Благодаря установке подрамника, кузов становится более жестким, следовательно уменьшается его резонанс и вибрация. А значит и уровень шума в салоне снижается. С помощью подрамника улучшается устойчивость и управляемость автомобиля.

Основные признаки выхода из строя сайлентблоков подрамника:

• Глухие и звонкие стуки со стороны подвески. Стоит отметить, что эти звуки могут полностью пропасть при определённых обстоятельствах, например, когда автомобиль полностью загружен, или даже перегружен;
• Отмечается сильная вибрация, при движении по некачественным дорогам, которой не было ранее;
• Снижение устойчивости автомобиля при движении на большой скорости или в процессе поворота;
• Нарушение углов развал-схождения колёс;
• Неравномерный износ покрышек.

Отметим, что снижение устойчивости автомобиля может привести к возникновению опасных дорожных ситуаций — особенно в гололёд, сильный дождь и зимнее время года. Нарушения в работе подвески могут спровоцировать завал автомобиля при повороте или его уход в занос. Поэтому не стоит халатно относиться к ходовой части, списывая всё на её «прочный» внешний вид и ощущение невозможности её поломки.

Замена сайлентблоков | «Оптимум Авто» — сеть автосервисов в Москве

×

Запрос по vin/frame

Услуга	Цена, р.
Замена сайлентблоков (без снятия/установки узла с а/м)	от 900

   

Специалисты сети автосервисов «Оптимум Авто» осуществляют профессиональную замену сайлентблоков подвески. Мы обслуживаем автомобили любых марок и моделей независимо от года выпуска. Предлагаем лучшие решения для восстановления работоспособности ходовой части Вашей машины.

Сайлентблок состоит из совмещенных втулок, пространство между которыми заполняется упругим демпфирующим материалом (как правило, резиной или полиуретаном). Главное назначение данного элемента — защита рычагов независимой подвески от радиальных и продольных нагрузок. Периодичность замены задних и передних сайлентблоков составляет обычно 50 000 километров пробега, однако этот период может быть существенно сокращен в результате эксплуатации на некачественных дорогах.

Неисправности, при которых необходима замена сайлентблоков балки

Большинство поломок резинометаллических шарниров проявляется в появлении трещин и нарушении конструктивной целостности элементов.

Водитель начинает ощущать:

• стуки в нижней части кузова;
• избыточную раскачку;
• плохую реакцию на поворот руля.

Кроме того, появляется невозможность регулировки угла установки колес.

При обнаружении этих проблем нужно провести срочную диагностику и замену сайлентблоков передних рычагов. Возможна также необходимость в замене сайлентблоков задних рычагов. Проверка состояния элемента начинается с визуального наружного осмотра. Если шарнир поврежден, на нем отчетливо видны трещины, разрывы материала, расслоения резиновых компонентов. При подергивании заметен люфт (свободный ход) элемента.

Помимо визуального осмотра, материально-техническая база «Оптимум Авто» позволяет осуществить точную диагностику шарниров на специальном вибростенде.

• Сеть техцентров Оптимум Авто является дочерним предприятием компании Toyota Tsusho Corporation (основанной в 1947 году)
• Наличие собственного склада запчастей позволяет нам выполнять ремонт в кратчайшие сроки
• Обучение специалистов Оптимум Авто происходит по стандартам официального дилера в ACADEMY BUSINESS CAR
• В сети автосервисов Оптимум Авто для всех наших клиентов действуют гарантия 2 года на выполняемые работы
• В каждом техцентре Вы можете наблюдать за ходом работ через веб камеры или присутствовать лично
• При выполнении работ мы соблюдаем регламенты обслуживания и технологии ремонта согласно стандартам завода изготовителя

 

Все работы выполняются опытными специалистами, отлично разбирающимися в конструктивных особенностях подвески автомобилей разных марок. Чтобы записаться на диагностику и замену сайлентблоков задней балки, оставьте заявку на сайте или посетите ближайший автосервис.

Другие услуги автосервисов «Оптимум Авто»:

цена, ремонт сайлентблока в КОРАВТО

Замена сайлентблоков в СПб: цена, ремонт сайлентблока в КОРАВТО

Список СТО и магазинов

• 89902095522″ data-coord2=»30.338262728172″ data-num=»0″>

  Лиговский пр-т, д. 246

  ежедневно (09.00-21.00)

• ул. Шателена, д. 9 (метро пл. Мужества)

  ежедневно (09.00-21.00)

• ул. Савушкина, д. 89

  ежедневно (09.00-21.00)

• пр. Народного ополчения, д. 201

  ежедневно (09.00-21.00)

• Колпино, ул. Братьев Радченко, 1 (заезд с ул. Финляндская)

  ежедневно (09.00-21.00)

Оставить заявку на ремонт

XДанный веб-сайт использует cookies и похожие технологии для улучшения работы и эффективности сайта. Для того чтобы узнать больше об использовании cookies на данном веб-сайте, прочтите Политику использования файлов Cookie и похожих технологий. Используя данный веб-сайт, Вы соглашаетесь с тем, что мы сохраняем и используем cookies на Вашем устройстве и пользуемся похожими технологиями для улучшения пользования данным сайтом.

Роль репликации ДНК в подавлении локусов «молчащего» типа спаривания в дрожжах

1

Astell, C.R. et al. Cell 27 , 15–23 (1981).

CAS Статья Google Scholar

2

Нэсмит, К. А., Татчелл, К., Холл, Б. Д., Астелл, К. Р. и Смит, М. Nature 289 , 244–250 (1981).

ADS CAS Статья Google Scholar

3

Хоторн, Д.C. Abstr. Proc. 11-й межд. Congr. Genet. 7 , 34–35 (1963).

Google Scholar

4

Herskowitz, I. & Oshima, Y. in The Yeast Saccharomyces cerevisiae (редакторы Strathern, JN, Jones, EW & Broach, J.) 181–211 (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, 1981) .

Google Scholar

5

Клар, А. Дж. С., Стрэтерн, Дж. Н., Броуч, Дж. Б. и Хикс, Дж. Б. Nature 289 , 239–244 (1981).

ADS CAS Статья Google Scholar

6

Abraham, J. et al. Колд Спринг Харб. Symp. квант. Биол. 47 , 989–997 (1983).

Артикул Google Scholar

7

Хабер, Дж. Э. и Джордж, Дж. П. Генетика 93 , 13–35 (1979).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

8

Клар, А. Дж. С., Фогель, С. и Маклеод, К. Генетика 93 , 37–50 (1979).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

9

Райн, Дж., Стрэтерн, Дж. Н., Хикс, Дж. Б. и Херсковиц, И. Генетика 93 , 877–901 (1979).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

10

Райн, Дж.О., дисс. , Ун-т. Орегон (1979).

11

Banerji, T., Rusconi, S. & Schaffner, W. Cell 27 , 299–308 (1981).

CAS Статья Google Scholar

12

Абрахам, Дж., Нэсмит, К. А., Стрэтерн, Дж. Н., Клар, А. Дж. С. и Хикс, Дж. Б. J. Molec. Биол. 176 , 307–331 (1984).

CAS Статья Google Scholar

13

Стинчкомб, Д.Т., Струл, К. и Дэвис, Р. В. Nature 282 , 39–43 (1979).

ADS CAS Статья Google Scholar

14

Beach, D., Piper, M. & Shall, S. Nature 284 , 185–187 (1980).

ADS CAS Статья Google Scholar

15

Chan, C. S. M. & Tye, B.-K. Proc. натн. Акад. Sci. U.S.A. 77 , 6329–6333 (1980).

ADS CAS Статья Google Scholar

16

Newlon, C. S. & Burke, W. в Механистические исследования репликации ДНК и генетической рекомбинации Vol. 19 (ред. Альбертс Б. и Фокс К. Ф.) 339–409 (Academic, New York, 1980).

Google Scholar

17

Селникер, С. Э. и Кэмпбелл, Дж.L. Cell 31 , 201–213 (1982).

CAS Статья Google Scholar

18

Миллер А. М. EMBO J , 3 , 1061–1065 (1984).

CAS Статья Google Scholar

19

Thorner, J. in The Yeast Saccharomyces cerevisiae (редакторы Strathern, J. N., Jones, E. W. & Broach, J.) 143–180 (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, 1981).

Google Scholar

20

Hartwell, L.H. J. molc. Биол. 104 , 803–817 (1976).

CAS Статья Google Scholar

21

Quinlan, R. A., Pogson, C. I. & Gull, K. J. Cell Sci. 46 , 341–352 (1980).

CAS PubMed Google Scholar

22

Килмартин, Дж.V. Биохимия 20 , 3629–3633 (1981).

CAS Статья Google Scholar

23

Херефорд, Л. и Хартвелл, Л. Х. J. Molec. Биол. 84 , 445–461 (1974).

CAS Статья Google Scholar

24

Gilbert, W. & Muller-Hill, B. in The Lactose Operon (ред. Beckwith, J. R. & Zipser, D.) 93–109 (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, 1970).

Google Scholar

25

Johnson, A. D. et al. Природа 294 , 217–223 (1981).

ADS CAS Статья Google Scholar

26

Salstrom, J. S. & Szybalski, W. J. Molec. Биол. 124 , 195–221 (1978).

CAS Статья Google Scholar

27

de Crombrugghe, B., Мудрый М., ДиЛауро Р. и Готтесман М. Cell 18 , 1145–1151 (1979).

CAS Статья Google Scholar

28

Alberts, B., Worcel, A. & Weintraub, H. в The Organization and Expression of the Eukaryotic Genome (eds Bradbury, EM & Javaherian, K.) 165–191 (Academic, New York, 1977).

Google Scholar

29

Контрерас, Р., Гейзен, Д., Ноулэнд, Дж., Ван де Вуд, А. и Фирс, В. Nature 300 , 500–505 (1982).

ADS CAS Статья Google Scholar

30

Келлер, Дж. М. и Алвин, Дж. К. Cell 36 , 381–389 (1984).

CAS Статья Google Scholar

31

Гейдушек, Э. П., Эллиотт, Т. и Кассаветис, Г.A. in Bacteriophage T4 (ред. Мэтьюз, К. К., Куттер, Э. М., Мозиг, Г. и Бергет, П. Б.) 189–192 (Am. Soc. Microbiol., Вашингтон, округ Колумбия, 1980).

Google Scholar

32

Elliott, T. & Geiduschek, E.P. Cell 36 , 211–219 (1984).

CAS Статья Google Scholar

33

Томас, Г. П. и Мэтьюз, М. Б. Cell 22 , 523–533 (1980).

CAS Статья Google Scholar

34

Hartwell, L. J. Cell Biol. 85 , 811–822 (1980).

CAS Статья Google Scholar

35

Рид С. И. Генетика 95 , 561–577 (1980).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

36

Нэсмит, К.A. Nature 302 , 670–676 (1983).

ADS CAS Статья Google Scholar

37

Bucking-Throm, E., Duntze, W., Hartwell, L.H., Manney, T.R. Expl Cell Res. 76 , 99–110 (1973).

CAS Статья Google Scholar

38

Херефорд, Л., Бромли, С. и Осли, М. А. Cell 30 , 305–310 (1982).

CAS Статья Google Scholar

39

Татчелл, К., Нэсмит, К. А., Холл, Б. Д., Астелл, К. Р. и Смит, М. Cell 27 , 25–35 (1981).

CAS Статья Google Scholar

40

Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. Proc. натн. Акад. Sci. США 74 , 5463–5467 (1977).

ADS CAS Статья Google Scholar

Подавленный гнев — реальная причина, по которой ваша жизнь застряла?

Вы из тех, кто любит говорить: «Я никогда не сержусь?»

Но в то же время вы тоже из тех, кто не может продвинуться по жизни, испытывает проблемы с чувством энергии и счастья, возможно, чувствуете, что коллеги вас не любят или придираются, и кто постоянно болеет гриппом или холодно?

Может быть, вы действительно страдаете от отрицания и подавления гнева.

15 признаков того, что вы могли скрыть и подавить гнев

Если у вас комбинация перечисленных ниже симптомов, возможно, вы постоянно отрицаете свои истинные эмоции.

1. Вы все время заняты. Занятость — верный способ избавиться от времени что-то чувствовать. Это может включать в себя созависимость, заботу о чужих проблемах вместо своих. И часто это значит быть трудоголиком.

2. Вы никогда не злитесь, но у вас постоянная легкая депрессия .Проблема с блокировкой одной эмоции заключается в том, что она часто мешает или блокирует нашу способность испытывать и другие эмоции, такие как радость и волнение. Также требуется много психологической энергии, чтобы держать вещи подавленными в нашем сознании, из-за чего мы чувствуем себя истощенными, заставляя некоторых называть депрессию «гневом, обращенным внутрь».

3. Вы известны своим саркастическим юмором. Подавляемый гнев часто выдается за сарказм, подлость или апатичное отношение «мне все равно».

4.Вы часто саботируете себя. Возможно, вы всегда опаздываете на работу, студент пропускает занятия или не реагирует на желаемые возможности, пока не станет слишком поздно и вы упустили возможность.

5. Вы ненавидите отказ . Привычка подавлять гнев часто возникает из-за того, что он рос в семье, где проявление эмоций привело к молчаливому остракизму. Это может оставить вас взрослым с глубоким страхом быть отвергнутым, который проявляется в ваших отношениях. Это также может проявиться в вашей рабочей среде, где вам могут сказать, что вы слишком чувствительны к критике.

6. Мелочи действительно беспокоят. Возможно, вы тот, кто в офисе всегда жалуется, если кто-то кладет обратно пакет молока в холодильник, в котором осталась только капля, или тот в спортзале, который очень расстроен, если кто-то не вытирает оборудование, которое он использовал . Это потому, что более сильный подавленный гнев ищет выхода, и он проявляется в форме разочарования и раздражения.

7. Вы страдаете от мышечного напряжения. Гнев должен куда-то уходить, и часто он переходит в наше тело, приводя к напряжению челюсти, боли в верхней части спины или постоянному напряжению желудка, что может привести к язве (если это вы, вы можете попробовать прогрессивное расслабление мышц) .

8. Вы страдаете от постоянной усталости, многих простуд или гриппа или, возможно, от хронической боли. Помимо мышечного напряжения, подавленный гнев может привести к беспокойству, которое влияет на сон, что затем снижает вашу иммунную систему. Что касается хронической боли, некоторые специалисты считают, что психогенная боль (физическая боль, вызванная или усугубляются психическими и эмоциональными факторами) может быть отвлечение, чтобы держать себя подальше от подавленных эмоций, хотя это до сих пор считается спорной теорией.

9.У вас нервные привычки. Такие вещи, как грызть ногти, жевать внутреннюю часть рта или ковырять кожу, могут быть признаками подавляемого гнева.

10. Вы боретесь с аддиктивным поведением. Это не обязательно должны быть наркотики или алкоголь. Возможно, вы шопоголик, любовный наркоман, чрезмерно тренируетесь или питаетесь. Зависимость часто является способом отвлечься от вещей, которые кажутся болезненными, и если мы испытываем боль из-за чего-то, мы также часто очень злимся на это.

11. Вы должны контролировать свою жизнь. Если мы контролируем эмоции, это может привести к желанию также контролировать нашу внешнюю среду.

12. Вас обвиняют в пассивной агрессии. Пассивная агрессия возникает, когда вместо того, чтобы прямо выражать гнев, мы делаем это косвенно. Это может включать в себя такие вещи, как доброе отношение к чьему-то лицу, но сплетничать о нем за его спиной, или сказать партнеру, что мы не злимся на что-то важное, например, на то, как он потратил месячный бюджет, но называть его ленивым из-за того, что он не выбрасывает мусор.

13. Вам сложно сказать «нет». Поскольку здоровый гнев — это то, что заставляет нас устанавливать границы, никогда не показывать гнев часто означает никогда не говорить «нет» или даже не осознавать, что можно.

14. В редких случаях, когда вы действительно расстраиваетесь, это, как правило, прорыв. Вы можете по-настоящему расстроиться только раз в год, но обычно это бывает взрывоопасно, и другие люди живут в страхе. Это то, что происходит, когда происходит нарастание эмоций.

15. Вы все время чувствуете себя счастливым, только чистым миром и любовью. Такая вера в себя обычно указывает на какое-то глубоко укоренившееся отрицание. Человеческий разум и эмоциональная система не односторонни. Никто не чувствует себя все время прекрасно. Если бы мы это сделали, мы бы ничему не научились, потому что мы растем, сталкиваясь с проблемами и контрастами, что включает в себя не всегда симпатию к тому, что делают и говорят другие люди.

Зачем мне подавлять гнев?

Вряд ли кто-нибудь однажды проснется и решит: «Хорошо, с этого момента я просто никогда не буду злиться». Вместо этого мы склонны подавлять гнев, не осознавая этого, убеждая себя, что у нас никогда не было таких чувств, как гнев, мы не относимся к эмоциональному типу или просто «рождены беспечными».

Тенденция подавлять гнев — это бессознательное решение, обычно формируемое основными убеждениями, которые вы приняли в детстве. Основные убеждения — это как решения, которые мы принимаем относительно того, как мы будем видеть мир, так и ценности, которые мы принимаем во внимание в отношении того, что важно, и основанные на том, что мы видим вокруг себя, и на опыте, который мы переживаем.

Как развить основную веру в то, что гнев никогда не следует выражать?

Возможно, в вашей семье эмоции были чрезмерно выражены бесполезным образом .Непрекращающиеся и непродуктивные ссоры между вашими родителями или членами семьи могли привести к тому, что ребенок, с вашей тогда еще уязвимой точки зрения, мог бы считать гнев опасным. Это было бы особенно важно, если бы между вашими родителями было физическое насилие, даже если это был всего лишь один случай, когда что-то было брошено.

Автор: Дэвид Сим

Если ссора ваших родителей означала, что у них мало времени на вас, вы, возможно, узнали, что гнев означает, что вы никогда не привлекали внимания .Как взрослый, стремящийся к успеху, вы воспринимаете гнев как нечто, что сделает вас незамеченным. Или вы можете рассматривать гнев как что-то, что ведет к гибели, если ваши родители развелись после долгих лет ссор.

Рост в семье, где эмоции выражены недостаточно или не проявляются вообще, может быть столь же разрушительным . Любое проявление эмоций могло быть встречено молчаливым опровержением, отрицательным ответом типа «не будь глупым, ты не очень расстроен» или формой отказа, когда тебя отправляли в свою комнату до тех пор, пока ты не узнал, как «вести себя как хороший ребенок».Хуже того, вам могло быть стыдно за то, что вы были эмоциональны. Это может привести к тому, что вы станете взрослым с основным убеждением, что, если вы покажете, что вы действительно чувствуете, вас не примут или не полюбят, или взрослым, который убежден, что у него вообще нет эмоций.

Еще один способ стать взрослым, сдерживающим гнев, — это если вы выросли с родителем, который поощрял созависимые отношения с ними. Это означает, что ваш родитель полагался на вас в своем чувстве счастья, возможно, сделав вас опекуном вместо них.Вы могли принять во внимание, что у вас не может быть отрицательных эмоций, или вы разрушите счастье тех, кого любите, и их печаль будет вашей ошибкой. Такой ребенок вырастает взрослым, который признает только свою «приемлемую» сторону и отрицает все остальное из-за глубоко укоренившегося страха быть отвергнутым.

Итак, что мне делать, если я думаю, что у меня проблемы с подавлением гнева?

Найдите время, чтобы узнать о здоровых способах справиться со своим гневом или даже о том, как в первую очередь распознать свои чувства.Вы можете начать с нашей статьи « Как бороться с гневом» .

Рассмотрите возможность работы с терапевтом. Подавляемый гнев, как правило, имеет глубокие корни, уходящие корнями в детство, и с ним бывает трудно справиться в одиночку. Психотерапевт создает для вас безопасное пространство, где вы можете продуктивно обрабатывать свой гнев. Особенно важно обратиться за помощью, если вы чувствуете себя подавленным гневом, когда начинаете обращаться за помощью.

Что важно в обучении освобождению от гнева, так это то, что вы отпускаете его для себя безопасным способом и понимаете, что гнев и насилие — это не одно и то же. Здоровое высвобождение гнева никогда не связано с жестоким обращением или насилием по отношению к себе или другому, или любому живому существу.

Если вы чувствуете, что гнев переполняет вас, и если в какой-то момент вы боитесь причинить вред себе или кому-то другому или прибегнете к насилию, обратитесь за помощью. Позвоните терапевту или на конфиденциальную горячую линию, например, круглосуточную горячую линию «Добрых самаритян» здесь, в Великобритании, по телефону 08457 90 90 90.

Фотографии qthomasbower, a4gpa, Роберта МакГолдрика, Марка Фалардо, Джеймса Палинзада, Жизелы Джардино, Жан-Пьера Дальбера

Polycomb Group Repression снижает доступность ДНК

Новые вставки P-элемента в BX-C. Мы построили элемент P с целевыми сайтами для наших трех зондов доступности (рис. 1). Во-первых, он несет сайты связывания дрожжевого активатора транскрипции GAL4 (GAL4-UAS) рядом с минимальным TATA-содержащим промотором, управляющим репортером LacZ. Мы можем использовать LacZ для мониторинга транскрипции, опосредованной Pol II, с активацией или без нее. Во-вторых, элемент P несет два тандемных промотора T7 длиной 49 п.н., ориентированных снаружи элемента P. Мы можем анализировать инициацию и удлинение с помощью T7RNAP, ища копии РНК геномных последовательностей, фланкирующих 3′-конец P-элемента.Наконец, кассета с промоторами Т7 и геном lacZ фланкирована сайтами рекомбинации FRT для фермента FLP. Иссечение кассеты как кольцевой эписомы можно контролировать косвенно, ища транскрипцию T7RNAP по кругу (рис. 1С).

Первоначальная задача при исследовании структуры ДНК, репрессированной PcG, состоит в том, чтобы ввести эти P-элементы в хромосомную область, которая, как известно, регулируется PcG. Мы воспользовались случайным примером самонаведения элемента P.Фрагмент ДНК из середины BX-C нацелен на элементы P преимущественно в область хромосомы, из которой он происходит (3). Этот «самонаводящийся фрагмент» включен в наш P-элемент вместе с розовым маркером ⁺ для трансформации в кассету, которая также окружена FRT (рис. 1A). Из 20 вставок, созданных трансформацией зародышевой линии, 5 находились внутри BX-C. Мы были обеспокоены тем, что ген rosy и / или хоминг-фрагмент могут влиять на структуру соседней ДНК.Поэтому мы использовали FLP-опосредованную рекомбинацию в зародышевой линии, чтобы обрезать четыре из пяти вставок до P-элементов размером 5,6 т.п.н., содержащих только промотор Т7 / кассету UAS-LacZ (рис. 1B). Большинство наших анализов в этой статье будет сосредоточено на четырех обрезанных вставках (p [bx], p [iab-4], p [Mcp] и p [Abd-B]) (рис. 2 и см. Ниже) .

Новые вставки P-элемента расположены довольно равномерно по всему кластеру гомеотических генов (Рис. 2). Самая центромера-проксимальная вставка находится внутри большого интрона гена Ubx в контрольной области bx (PS5).Самое проксимальное основание повтора сайта-мишени длиной 8 п.н. находится в положении 274,398 на карте последовательностей Martin et al. (28). Вторая вставка находится выше гена Ubx , в контрольной области bxd (PS6) (в положении 219 568). Эта вставка находится в области bxd PRE, наиболее четко определенного связывающего фрагмента PcG (18). Третья вставка находится в контрольной области iab-4 (PS9), выше гена abd-A (в положении 125 800). Четвертая вставка находится в граничной области Mcp (32) между контрольными областями iab-4 и iab-5 (113 871).Пятая вставка (49 855) находится на 658 п.н. ниже промотора гена abd-B (класс A).

В дополнение к вставкам BX-C мы сгенерировали строки с помощью нашей конструкции теста доступности за пределами BX-C в качестве элементов управления, не регулируемых PcG. Эти P-элементы не содержат хоминг-фрагмент и были идентифицированы с использованием гена mini- white в качестве маркера. Две из этих контрольных линий использовались для анализов в этой статье. Один расположен в области 18D на Х-хромосоме и был картирован с помощью обратной ПЦР (35) на первый экзон предполагаемого гена CG14200.Промоторы Т7 ориентированы в противоположном направлении от предполагаемого транскрипта. Второй контроль расположен на третьей хромосоме и не был нанесен на карту. Репортеры LacZ в обоих контролях не обнаруживают паттерна ловушек энхансеров во время эмбрионального развития (см. Ниже). Более того, анализ РНК in situ контроля Х-хромосомы с помощью смысловых и антисмысловых зондов к соседней геномной ДНК показывает отсутствие транскрипции области с потенциальных соседних промоторов на стадиях развития, на которых проводились наши анализы доступности.(Мы не тестировали экспрессию во время личиночной, куколочной или взрослой стадии. )

Активация Gal4 транскрипции Pol II репрессируется PcG. В отсутствие Gal4 репортер UAS-LacZ в каждой вставке BX-C отвечает. к соседним энхансерным последовательностям, давая начало паттерну экспрессии LacZ, который пространственно ограничен определенными сегментами (фиг. 3B-E). Контроли показывают отсутствие экспрессии LacZ в отсутствие Gal4 (контроль 3-й хромосомы, фиг. 3A [контроль X-хромосомы не показан]).Для каждой из вставок в BX-C экспрессия LacZ отражает сегменты, в которых активна сегментарная контролирующая область, окружающая вставку P. Сегменты, в которых отсутствует экспрессия LacZ, — это те сегменты, в которых область вставки репрессируется PcG (30). Когда Gal4 экспрессируется в контрольных эмбрионах из повсеместного источника (линия 32B), ген LacZ сильно активируется во всех сегментах (контроль 3-й хромосомы, рис. 3F). Напротив, активация Gal4 сегментарно ограничена во вставках BX-C (рис.3G в J). Хотя некоторая активация происходит в сегментах, репрессированных PcG, гораздо большее количество клеток обнаруживает высокий уровень транскрипции LacZ в нерепрессированных сегментах. Gal4 не активируется одинаково во всех клетках, даже в не репрессированных сегментах. Более того, активированный Gal4 паттерн не является усилением неактивированного паттерна. Gal4, по-видимому, сложным образом взаимодействует с соседними энхансерными элементами. Однако во всех случаях активация Gal4 существенно блокируется в PcG-репрессированных сегментах.

Рис. 3.

Gal4 частично блокируется PcG. (От A до E) Шаблоны ловушки усилителя в строках вставки P. Гибридизации РНК in situ, показывающие экспрессию LacZ (в отсутствие Gal4) в эмбрионах с ретракцией зародышевой полосы. (A) Контрольный эмбрион, содержащий кассету UAS-LacZ на 3-й хромосоме за пределами BX-C, не показывает экспрессии LacZ. (От B до E) Урезанные вставки p [bx], p [iab-4], p [Mcp] и p [Abd-B], соответственно. Самый передний парасегмент, в котором происходит транскрипция, отмечен скобкой.(F к J) Активация Gal4 экспрессии LacZ. (F) Gal4 сильно активирует экспрессию LacZ во всем контрольном эмбрионе. (G к J) Активация Gal4 в p [bx], p [iab-4], p [Mcp] и p [Abd-B] соответственно. Экспрессия LacZ намного слабее или отсутствует в PcG-репрессированных сегментах. Самый передний парасегмент, в котором происходит сильная активация транскрипции LacZ, отмечен скобкой. Все эмбрионы, показанные на этом и последующих рисунках, рассечены по спинной средней линии и показаны как «шкуры», причем передняя часть ориентирована к верхней части страницы.

Уровень транскрипции из тестового сайта Abd-B оказывается значительно ниже в присутствии Gal4. Этот репортер LacZ расположен примерно на 700 п.н. ниже стартового сайта РНК для Abd-B и находится в той же ориентации, что и транскрипт Abd-B . Мы подозреваем, что неактивированный паттерн (фиг. 3E) является результатом считывания с промотора Abd-B , создавая паттерн, подобный Abd-B-. Gal4 может связываться с промотором UAS в PS11–14, блокируя считывание с промотора Abd-B .Он может успешно активировать только высокие уровни транскрипции в PS13, в котором контрольная область, окружающая сайт вставки, активна и не репрессирована PcG. В любом случае активированный узор лучше отражает сегментарную контрольную область ( iab-8 ), в которой находится цель.

Паттерн p [Mcp] LacZ начинается в PS10 у неактивированных эмбрионов, но начинается в PS9 после активации Gal4. Этот сдвиг может быть связан с нарушением граничного элемента Mcp между сегментными доменами iab-4 и iab-5 (20).Фактически, взрослые мухи p [Mcp] обнаруживают слабый фенотип Mcp (пигментированная кутикула на 4-м тергите брюшка), который значительно усиливается у мух, экспрессирующих Gal4. Ни одна из других линий не обнаруживает каких-либо фенотипических изменений в присутствии Gal4.

Изменения паттерна у мутантов PcG. У мутантных эмбрионов Polycomb ^— ( Pc ^— ) гомеотические гены включаются неправильно в передних сегментах. Сходным образом, в Pc ^— эмбрионах, содержащих наши вставки, паттерн LacZ теряет свое сегментарное ограничение.Репортер Abd-B демонстрирует сильную экспрессию в грудном и брюшном сегментах у мутанта Polycomb (фиг. 4D). Опять же, мы подозреваем, что это отражает считывание с промотора Abd-B . Однако в линиях вставки bx , iab-4 и Mcp только несколько ячеек в каждом сегменте включают LacZ (рис. 4A-C). Кроме того, паттерн изменяется в задних сегментах с потерей экспрессии в некоторых клетках. Мы также проанализировали эмбрионы с мутациями, специфичными для других членов PcG, включая дополнительных половых гребней , задних половых гребней , полигомеотических и плеогомеотических (генотипы см. В материалах и методах).Все мутантные эмбрионы давали паттерны, аналогичные паттернам Pc ^— эмбрионов (данные не показаны). Сначала мы были удивлены, что наши вставки не показали широко распространенной транскрипции в фонах мутантов PcG. Ранее обнаруженные ловушки энхансера BX-C показали сильную и широко распространенную неправильную экспрессию в мутантных эмбрионах PcG (30). Большинство этих ловушек энхансера управлялись промотором гена Ubx (включая 1,7 т.п.н. 5′-фланкирующих последовательностей), и все включали ген rosy в качестве репортера.Наблюдаемая сильная неправильная экспрессия могла быть результатом активации энхансерных последовательностей в P-элементах. Мы полагаем, что слабый промотор в наших новых вставках полностью зависит от энхансеров соседних гомеотических генов и, таким образом, лучше отражает влияние потери PcG на эти контролирующие гомеотические гены области. Мы протестировали другие P-элементы в BX-C, которые содержат только LacZ, управляемый промотором P (полученным от «почтовых голубей» ссылки 3). Они ведут себя аналогично нашим новым вставкам, демонстрируя слабую экспрессию в эмбрионах Pc ^— (не показаны). Эти результаты показывают, что потеря PcG сама по себе не приводит к широко распространенной активации энхансеров дальнего действия в BX-C. Более того, это показывает, что PcG влияет на активность этих энхансеров не только в репрессированных сегментах, но также и в транскрипционно активных сегментах. Однако изменения могут быть косвенными, в результате плейотропных эффектов у мутантов PcG. Потеря PcG должна вызывать неправильную экспрессию генов, отличных от гомеотических, некоторые из которых могут быть факторами транскрипции, способными связываться с контролирующими гомеотическими областями.

Рис. 4.

Мутантные эмбрионы Polycomb обнаруживают слабое распространение экспрессии LacZ, но позволяют Gal4 активировать транскрипцию LacZ по всему эмбриону. На всех панелях показана гибридизация in situ с LacZ РНК в эмбрионах с ретракцией зародышевой полосы. (От A до D) Образцы ловушек энхансера в зиготических нулевых эмбрионах Polycomb , содержащих вставки p [bx], p [iab-4], p [Mcp] и p [Abd-B], соответственно. (От E до H) Активация Gal4 транскрипции LacZ в зиготических нулевых эмбрионах Polycomb .

Активация

Gal4 была также протестирована на ПК ^— эмбрионов.Во всех четырех тестируемых вставках (рис. 4E-H) Gal4 сильно активировал экспрессию во всем грудном и брюшном сегментах. Уровень активации снижается в самых задних сегментах (от A6 до A8) для вставки iab-4 по неизвестным причинам. Уровень экспрессии LacZ в мутантах Polycomb со вставкой Abd-B ниже в присутствии Gal4, чем в его отсутствие, предположительно из-за конкуренции между промотором UAS и промотором гена Abd-B выше.Во всех вставках BX-C Gal4 все еще не активирует транскрипцию во всех клетках, как это происходит в контроле (сравните фиг. 4E с H и фиг. 3F). Соседние последовательности BX-C влияют на активацию Gal4, в результате чего клеточно-специфический паттерн повторяется в каждом сегменте, причем паттерны различаются для каждого сайта инсерции LacZ. Более того, клеточная специфичность этих паттернов различается между мутантом PcG и состоянием дикого типа (сравните фиг. 4E-H с фиг. 3G-J), даже в задних сегментах, которые транскрипционно активны в присутствии PcG.Опять же, косвенные эффекты PcG на соседние энхансеры являются проблемой. Однако тот факт, что Gal4 работает более или менее одинаково хорошо во всех сегментах мутантов PcG, вероятно, отражает изменение доступа или активности Gal4 и, потенциально, изменение доступа соседних энхансерных последовательностей к другим факторам, действующим на trans . В сочетании с результатами T7RNAP и FLP, представленными ниже, этот результат поддерживает модель, согласно которой PcG отвечает за ремоделирование хроматина на больших расстояниях в этих регионах.

Транскрипция T7RNAP частично блокируется PcG. Чтобы проверить, влияет ли PcG на транскрипцию T7RNAP, мы пересекли линии мух, содержащие новые вставки промотора T7, с источником T7RNAP, который конститутивно экспрессируется в клетках ЦНС ( 29). Транскрипцию T7RNAP геномных последовательностей, примыкающих к вставкам промотора T7, визуализировали с помощью анализа РНК in situ эмбрионов (рис. 5). Как сообщалось ранее (29), для обнаружения транскриптов T7RNAP требуется кратковременная обработка эмбрионов при 37–39 ° C, возможно, из-за повышенной стабильности транскриптов.

Рис. 5.

Транскрипция с помощью T7RNAP частично блокируется PcG на нескольких сайтах в BX-C. Гибридизация РНК in situ в эмбрионах с ретракцией зародышевой ленты. Все эмбрионы содержали источник T7RNAP, который экспрессируется в ЦНС. (A) Контроль представляет собой эмбрион, содержащий элемент P с промотором T7 / кассетой UAS-LacZ, вставленным в X-хромосому. T7RNAP продуцирует транскрипт в клетках ЦНС от PS3 до -14, отражая характер экспрессии полимеразы. (От B до F) Транскрипция с помощью T7RNAP во вставках BX-C.На панелях C и D использовались исходные полноразмерные P-элементы, а на панелях B, E и F — урезанные формы. Самый передний парасегмент, в котором активна контрольная область, указан для каждого эмбриона. В передних сегментах, репрессированных PcG, T7RNAP продуцирует транскрипт только в подмножестве продуцирующих полимеразу клеток.

CNS-T7RNAP эффективно транскрибирует ДНК, соседствующую с контролем Х-хромосомы, что приводит к повторяющемуся паттерну продуктов РНК от PS3 до -14 (рис.5А). Это происходит, несмотря на отсутствие эндогенной транскрипции в этой области. Паттерн продуктов РНК T7RNAP в этом эмбрионе имитирует паттерн экспрессии полимеразы, как это видно с помощью антитела против T7RNAP (см. Фиг. 6C ссылки 29). Напротив, во вставках BX-C повторяющийся образец транскрипции с помощью T7RNAP присутствует только в сегментах, не блокированных репрессией PcG. В более передних сегментах (а также в самых задних сегментах), репрессированных с помощью PcG, только субнабор полимераза-положительных клеток маркируется продуктом транскрипции T7RNAP.T7RNAP, по-видимому, блокируется в случайном подмножестве клеток, картина напоминает разнообразную репрессию, индуцированную геном miniwhite в трансгенных конструкциях, содержащих PRE (9). Поскольку T7RNAP способен к транскрипции без каких-либо факторов транскрипции Drosophila , блокировка транскрипции предполагает, что T7RNAP не может связываться со своими промоторами и / или продвигаться вдоль PcG-репрессированной ДНК.

Несоответствие с предыдущими анализами T7. В предыдущей публикации этой лаборатории сообщалось, что PcG не влиял на T7RNAP, что было определено путем транскрипции из вставки в области bx , содержащей четыре промотора T7 (29).Наши повторения этого эксперимента подтверждают предыдущие результаты. Между настоящим и предыдущим экспериментами есть несколько различий, которые могут объяснить разные результаты. Каждая из пяти наших новых вставок содержит только два промотора Т7, тогда как большая часть работы в предыдущем исследовании была выполнена на одной вставке с четырьмя промоторами. Зонд, использованный для анализа РНК in situ в предыдущем исследовании, включал последовательности, расположенные непосредственно после промоторов. В нашем исследовании последовательности зонда начинаются примерно на 300 п.н. ниже сайта начала транскрипции, поскольку полимераза должна транскрибироваться через последовательности FRT и 3’P, прежде чем достигнет соседней геномной ДНК.Наиболее существенное различие может заключаться в контексте промоторов Т7. Хотя наша новая линия вставки bx расположена близко к положению вставки промотора Т7, описанному McCall и Bender (29), вполне возможно, что ∼250 п.н. между двумя вставками достаточно, чтобы вызвать различия в поведении Промоторы Т7. Также вполне возможно, что промотор UAS-TATA Pol II в наших новых вставках влияет на соседние промоторы T7. Однако, как проиллюстрировано ниже, мы действительно обнаруживаем эффект доступности на простую мишень промотора T7 (29) за счет увеличенной версии T7RNAP, и поэтому блок PcG не может быть исключительно эффектом ближайшего промотора Pol II.Мы также обнаружили, что после продолжительной экспрессии T7RNAP не наблюдается блокады PcG транскрипции T7RNAP (см. Фиг. 6 и 7). Очевидно, что блокировка PcG транскрипции Т7 является частичной и чувствительной к условиям анализа.

Увеличенная версия T7RNAP более чувствительна к репрессии PcG. Чтобы проверить, имеет ли значение размер для PcG, мы увеличили размер T7RNAP, объединив его с β-галактозидазой. Этот слитый белок образует плотный тетрамер размером ~ 860 кДа, что более чем в восемь раз превышает размер T7RNAP дикого типа, но все же значительно меньше, чем холофермент Pol II.Мы называем этот гибридный белок «полимеразой Голиафа» (рис. 6А).

Рис. 6.

Увеличенная полимераза более чувствительна к репрессии PcG. (A) Рисунок, сравнивающий T7RNAP дикого типа и полимеразу Голиафа. (B) Структура белка полимеразы Голиафа в линии ЦНС Голиафа в эмбрионе, втянутом в зародышевую полоску. Расположение полимеразы Голиафа определяли с помощью моноклональных антител к β-галактозидазе. PS5, передний предел активности энхансера bx , обозначен скобкой. (C) Транскрипция полимеразой Голиафа на промоторах 4 × T7 в контрольной области bx в эмбрионе с ретракцией зародышевой полосы. Транскрипция Голиафа блокируется перед PS5. (D) Транскрипция полимеразой Голиафа в дополнительных половых сотах мутантного эмбриона ( esc ² / esc ¹⁰ , материнский и зиготический ноль). Утрачивается репрессия в передних сегментах. (От E до H) T7RNAP по сравнению с полимеразой Голиафа, как показано экспрессией полимераз с системой Gal4-UAS. Вездесущий источник Gal4 (строка 32B) использовали для управления экспрессией полимеразы.Все эмбрионы находятся в стадии расширенного зародышевого пояса. (E) Белковая структура полимеразы Голиафа, помеченная антителом к ​​β-галактозидазе. (F) Транскрипция с помощью T7RNAP на промоторах 4 × T7 в контрольной области bx . Транскрипция не зависит от PcG. (G) Транскрипция полимеразой Голиафа. Транскрипция подавляется PcG перед PS5. (H) Транскрипция полимеразой Голиафа в мутанте Polycomb (зиготический нуль). Утрачивается репрессия в передних сегментах.

Мы ввели полимеразу Голиафа мухам и обнаружили вставку на 3-ей хромосоме, которая конститутивно экспрессирует полимеразу в ЦНС (рис.6Б). Мы проанализировали способность полимеразы Голиафа транскрибировать из вставки промотора 4 × T7, описанной McCall и Bender (29), которая расположена в контрольной области bx (рис. 2). Транскрипция полимеразой Голиафа ЦНС была видна только в рекомбинантных линиях, содержащих источник полимеразы Голиафа и промоторы Т7 на одной и той же хромосоме. Либо две копии источника полимеразы ЦНС Голиаф, либо гомозиготность вставок промотора Т7 были необходимы для достижения достаточно высоких уровней транскрипции.

Транскрипция полимеразой Голиафа, по-видимому, блокируется в большинстве клеток в сегментах, репрессированных PcG (рис. 6С). Этот блок зависит от PcG, что продемонстрировано повторением эксперимента на животном, у которого отсутствует белок Extra Sex Combs. У этих мутантных эмбрионов PcG полимераза Голиафа одинаково хорошо транскрибируется во всех сегментах (рис. 6D). Мы также протестировали полимеразу ЦНС Голиафа на новых вставках p [bx] и p [Abd-B], опять же с гомозиготными как исходным, так и целевым объектами. Транскрипция полимеразы Голиафа с этих промоторов слабая, но жестко ограничена соответствующими сегментами ЦНС (данные не показаны).

Для более прямого сравнения полимеразы Голиафа и нормального T7RNAP мы сконструировали линии мух, которые содержат конструкции экспрессии, индуцируемые Gal4, либо T7RNAP, либо полимеразы Голиафа. Это позволило нам выразить полимеразы в различных формах и на сопоставимых уровнях. На рис. 6Е показан паттерн экспрессии полимераз при скрещивании с драйвером 32B Gal4, который описывается как повсеместный источник Gal4 (8). В этих условиях, по данным вставки промотора 4 × T7, блокирование транскрипции с помощью T7RNAP не наблюдается (рис.6F). Транскрипция с помощью полимеразы Голиафа, напротив, все еще сильно снижена в сегментах, которые репрессируются PcG (Рис. 6G). Ограничение исчезает у эмбриона, лишенного белка Polycomb (рис. 6H). Мы не тестировали Gal4-индуцируемые полимеразы ни на одной из новых линий, поскольку эти вставки содержат сайты связывания Gal4 непосредственно перед промоторами Т7. Связывание Gal4 с этими сайтами может влиять на структуру хроматина промоторов T7.

Сегментарное ограничение транскрипции полимеразой Голиафа исчезает в оттянутых зародышевых полосках (стадии 13–14) и более старых эмбрионах (данные не показаны).Однако западный анализ показывает, что подмножество полимеразы Голиафа (экспрессируемой при индукции Gal4) становится обрезанным. Подрезанные формы видны даже у ранних зародышей, но более стриженные формы, по-видимому, накапливаются в более старых эмбрионах. Некоторые из них, вероятно, являются функциональной полимеразой, с которой остается присоединенным только небольшой С-концевой фрагмент пептида β-галактозидазы. Такое слияние больше не сможет образовывать тетрамеры, и можно ожидать, что он будет вести себя как его аналог дикого типа. T7RNAP дикого типа при высокой экспрессии не ингибируется PcG (рис. 6F).

Хотя мы предпочитаем модель, согласно которой полимераза Голиафа более чувствительна к репрессии PcG из-за своего размера, она, возможно, более чувствительна, поскольку является менее эффективной полимеразой, чем нативный T7RNAP. Нозерн-анализ транскриптов T7RNAP в эмбрионах (от 0 до 24 ч) показывает широкое распределение продуктов РНК со средним размером транскрипта ~ 1,5 т.п.н. (в диапазоне до ~ 5 т.п.н.). Транскрипты, созданные полимеразой Голиафа, имеют аналогичное распределение по размерам, но их количество в ~ 10 раз меньше. Однако возможно, что различие в распределении транскриптов по размеру маскируется вкладом продуктов обрезанного слитого белка.

Чтобы проверить представление о том, что поврежденные полимеразы по-разному чувствительны к репрессии PcG, мы получили три мутировавшие полимеразы Т7, которые были дефектными по связыванию промотора, удлинению и продвижению через сайты паузы, соответственно (см. Материалы и методы). Все три формы были введены мухам под контролем Gal4. Основываясь на сравнениях in vitro, мы ожидали, что мутантные формы будут равны или превосходят активность полимеразы Голиафа (данные не показаны). T7RNAP, дефектный при переходе через сайты паузы, работал одинаково хорошо во всех сегментах.К сожалению, мы не смогли обнаружить транскрипцию у мух ни с помощью связывания промотора, ни с помощью мутантных полимераз по элонгации, и поэтому не смогли проверить их чувствительность к репрессии PcG.

FLP-опосредованная рекомбинация блокируется Polycomb. Кассета, содержащая репортер UAS-LacZ и промоторы T7, фланкируется FRT, ориентированными как прямые повторы. Введение рекомбиназы FLP в соматические ткани эмбриона позволяет вырезать эту кассету из хромосомы в 4.Круговая эписома размером 9 т.п.н. (рис. 1С). Промоторы T7 на этом эписоме теперь готовы к транскрипции по кругу, производя антисмысловые копии LacZ. Если рекомбинация FLP блокируется, эписома не образуется, а промоторы Т7 остаются в хромосоме, готовые транскрибировать фланкирующую геномную ДНК. Поэтому мы ввели как источник FLP, так и источник T7RNAP в наши урезанные линии вставки для анализа активности FLP клетка за клеткой (рис. 7). Мы провели гибридизацию кРНК in situ с фланкирующей хромосомной ДНК в качестве зонда, чтобы выделить клетки, в которых FLP не смог вырезать кассету (рис.7F-J) и зонд для антисмыслового LacZ для выделения клеток, в которых присутствовали круги (фиг. 7K-O).

Рис. 7. Рекомбиназа

FLP частично блокируется PcG. Гибридизацию РНК in situ использовали для различения промоторов Т7 в хромосоме или в FLP-индуцированных кругах в эмбрионах с ретракцией зародышевой полосы. (От A до E) Контрольные эмбрионы без FLP. Зонды РНК обнаруживают транскрипцию фланкирующих геномных последовательностей с промоторов Т7 во вставках P. В отсутствие FLP все кассеты промотора Т7 остаются в хромосоме и готовы транскрибировать фланкирующую геномную ДНК.В этих условиях анализа не наблюдается сегментарного смещения транскрипции с помощью T7RNAP ни в одной из линий мух. (F до J) Транскрипция хромосомных последовательностей с помощью T7RNAP маркирует клетки, в которых FLP не смог получить доступ к своим сайтам-мишеням FRT, которые фланкируют промотор T7 / кассету UAS-LacZ. (F) FLP эффективно вырезает кассету из большинства клеток контрольной линии, в которой кассета расположена на Х-хромосоме. (От G до J) В линиях вставки BX-C FLP не может вырезать кассету во многих клетках в сегментах, репрессированных PcG.Формирование блока к кругу, по-видимому, происходит на один парасегмент перед блоком транскрипции Pol II. Самый задний парасегмент, в котором транскрипция хромосомы сильна, отмечен скобкой. (От K до O) Транскрипция антисмысловой РНК LacZ с помощью T7RNAP маркирует клетки, в которых FLP преуспел в образовании кольцевой эписомы. (K) Круги видны в большинстве клеток контрольного эмбриона. (L к O) На линиях вставки BX-C видно большее количество кругов в сегментах, не репрессированных PcG.Самый передний парасегмент, в котором видна плотная окружность, отмечен скобкой.

Для проведения эксперимента по доступности FLP мы использовали как источник FLP, индуцируемый тепловым шоком, так и источник T7RNAP, индуцируемый тепловым шоком. Эмбрионы подвергали тепловому шоку в течение 1 ч при 36,5 ° C для получения FLP и T7RNAP. Затем их инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре для обеспечения активности FLP. Затем эмбрионы подвергали тепловому шоку во второй раз при 39 ° C в течение 1 ч, чтобы позволить продуктам T7RNAP накапливаться.В этих условиях не наблюдается сегментарного смещения в способности T7RNAP транскрибировать с его промоторов либо в контрольных эмбрионах (контроль Х-хромосомы, фиг. 7A), либо в тестовых линиях BX-C, в которых отсутствует FLP (фланкирующий зонд, фиг. 7B). палец). Ни одна из линий не показывала никакого сигнала с круговым зондом в отсутствие индукции FLP. У контрольных эмбрионов с FLP круги образуются из большинства клеток, даже несмотря на отсутствие эндогенной транскрипции через сайт контрольной вставки (сравните фланкирующий зонд, рис.7F, чтобы обвести зонд, рис. 7K). Анализ контроля 3-й хромосомы с помощью кругового зонда показал, что он вёл себя аналогичным образом (данные не показаны). В формировании круга от контрольных линий нет сегментарного смещения.

Напротив, активность FLP блокируется от вставок BX-C специфичным для сегмента способом. Эффект наиболее очевиден на прошивках iab-4 и Mcp . Для обеих этих вставок хромосомный зонд, который выделяет клетки, в которых не работает FLP, выборочно отмечает передние сегменты, в которых, как ожидается, PcG репрессирует ДНК (рис.7H и I). Круглый зонд выборочно маркирует дополнительные задние сегменты, в которых не ожидается, что PcG репрессирует ДНК (фиг. 7M и N). Интересно, что переходы в паттернах окрашивания очевидны на один парасегмент впереди ожидаемых ограничений PcG (как определено паттернами ловушек LacZ энхансера на фиг. 3). Это указывает на то, что изменение структуры хроматина может быть ограничено только частичной репрессией участков ДНК на краях домена, репрессированного PcG.

В вставке bx ограничение FLP менее полное.Используя хромосомный зонд для выделения клеток, в которых не работает FLP, выборочно выделяется PS3 (рис. 7G). Опять же, это на один парасегмент впереди ожидаемого; энхансер bx управляет экспрессией репортера LacZ, начиная с PS5. Многие эмбрионы bx демонстрируют широко распространенную активность FLP, определенную с помощью кругового зонда (данные не показаны). Однако у большинства эмбрионов наблюдается явное смещение с круговым датчиком (рис. 7L), хотя этот рисунок не является строго комплементарным по отношению к хромосомному датчику.Наиболее сильно помечены PS4 и -5, затем идут PS3 и абдоминальные парасегменты. Это действительно соответствует уровням транскрипции от репортера LacZ (Fig. 3B), который выше в PS5 и -6, чем в более задних парасегментах. Однако паттерн активности FLP сдвигается на один сегмент вперед от паттерна LacZ.

Вставка Abd-B также показывает воспроизводимое смещение в активности FLP, как определено хромосомным зондом; маркировка в большинстве случаев исключена из самых задних сегментов (от PS11 до -13) (рис.7J). Многие из эмбрионов со вставкой Abd-B показали широко распространенную активность FLP, как было определено с помощью зонда в виде круга (данные не показаны). Некоторые, однако, показали смещение в образовании кругов в самых задних сегментах (от PS11 до -13), как показано на рис. 70. В целом, активность FLP показала меньшее сегментное смещение во вставках bx и Abd-B , чем во вставках iab-4 и Mcp . Возможно, это связано с тем, что первые находятся в активно транскрибируемых областях гомеотических генов, тогда как вторые находятся вне гомеотических транскриптов.Хромосомный зонд показывает более четкое сегментарное смещение, чем круглый зонд для всех четырех сайтов вставки. Целевой сайт FLP находится непосредственно ниже промоторов Т7. Связывание только FLP может блокировать транскрипцию соседних хромосомных последовательностей с помощью T7RNAP. Круглый зонд, напротив, должен давать сигнал только в том случае, если FLP связывает и рекомбинирует ДНК. Если FLP связывает ДНК в большинстве нерепрессированных клеток, но образует круг только в подмножестве этих клеток, мы можем наблюдать разницу между результатами хромосомного и кругового зондов.

Тот факт, что рекомбиназа FLP, дрожжевой белок, не участвующий в транскрипции, избирательно блокируется сегмент-специфическим образом из вставок BX-C, но не из контрольных вставок, также предполагает, что структура ДНК BX-C изменяется в PcG-репрессированных сегментах. Этот результат аналогичен тому, что сообщается в ссылке 1, в которой сильное ингибирование рекомбинации FLP наблюдалось в сайтах-мишенях, расположенных рядом с центральным гетерохроматином.

Уменьшение доступности ДНК, репрессированной с помощью PcG, не связано с изменением суперспирализации ДНК.Мы сравнили плотность суперспиралей PcG-репрессированных и нерепрессированных ДНК с использованием наших кассет FLP для получения внехромосомных эписом. Мы скрестили наши тестовые линии доступности с источником рекомбиназы FLP, индуцируемым тепловым шоком, индуцировали активность FLP, а затем собрали общую геномную ДНК, которая должна включать недавно вырезанные круги (рис. 1C). Эта ДНК была подвергнута гель-электрофорезу в присутствии хлорохина, который разрешил суперспиральные круги на лестницу отдельных полос. Соседние ступеньки лестницы отличаются одним сверхспиральным витком, а топоизомеры окружностей описывают гауссово распределение.Гели хлорохина подвергали саузерн-блоттингу и зондировали последовательностями lacZ , содержащимися в нашей FLP-индуцибельной кассете (фиг. 8). С помощью этого метода можно увидеть воспроизводимое изменение числа связей до 1.

Рис. 8.

Репрессия PcG не связана с измененной суперспирализацией ДНК. Круглые эписомы, полученные из кассет FLP, подвергали электрофорезу в агарозных гелях с добавлением 2 мкг хлорохина на мл. В этих условиях более отрицательно свернутая ДНК имеет более быструю подвижность. Гели подвергали саузерн-блоттингу и зондировали последовательностью lacZ . (A) Тотальную геномную ДНК получали из голов взрослых мух либо сразу после 1-часовой обработки тепловым шоком для индукции активности FLP (60 ‘), либо через 1 час теплового шока плюс 2 часа восстановления при комнатной температуре (180’). . Все круги, образующиеся в линиях p [bx], p [iab-4], p [Mcp] и p [Abd-B], происходят из ДНК, репрессированной с помощью PcG. Контролем является вставка 3-й хромосомы, которая не подавляется PcG. Среднее количество стыковок примерно одинаково для всех полос.Положения необработанной ДНК, остающейся в хромосоме (ch), и кружков с надрезом (nc) отмечены стрелками. Среднее число связей для образца в первой полосе указано стрелкой (см. Материалы и методы). (B) Полная геномная ДНК была получена из целых эмбрионов после 1 часа теплового шока плюс получаса восстановления при комнатной температуре для индукции активности FLP. Эту ДНК подвергали анализу хлорохинового геля и саузерн-блоттингу, как описано выше. Круги, полученные из линии p [Mcp] с активностью PcG дикого типа, сравнивают с кругами, полученными из линий p [Mcp] и p [Abd-B], которые являются нулевыми для белка Polycomb.Потеря репрессии PcG не изменяет топологию ДНК в этих областях.

Сначала мы спросили, сохраняется ли репрессия PcG на вновь вырезанных кругах. Мы исследовали паттерны экспрессии lacZ у эмбрионов с нашими вставками после индукции FLP. Паттерны экспрессии LacZ были сходными до и после образования круга, но паттерны были слабее после индукции FLP (данные не показаны). Аналогичным образом, аналогичные паттерны lacZ наблюдались после активации Gal4 в присутствии или в отсутствие FLP.Опять же, уровень транскрипции был несколько ниже после образования круга. Таким образом, нет никаких доказательств потери репрессии PcG из-за образования круга; во всяком случае, круги могут замолчать в клетках, где трансген был активен в хромосоме. Ахмад и Голич (1) показали, что круги, вырезанные из гетерохроматиновых участков, становятся транскрипционно активными. Их анализ отслеживал изменения в экспрессии гена white в глазу взрослого человека после индукции FLP несколькими днями ранее, во время развития личинок или куколок.Наши результаты показывают, что активация кругов у эмбрионов не происходит в течение 3-часового окна наших экспериментов.

Затем мы использовали анализ хлорохинового геля для изучения кругов, полученных из целых эмбрионов, чтобы сравнить топологию наших вставок BX-C с контрольными вставками. Наибольшая разница в среднем числе связывания (ΔLK) между любой парой образцов составляла менее 0,5 сверхспиральных витков (данные не показаны). Таким образом, мы не считаем, что было существенное различие в топологии кругов, собранных из наших контрольных линий, по сравнению с любой из наших вставок BX-C.Мы ожидаем, что круги, полученные из вставок BX-C, были получены из смеси сегментов, репрессированных и не репрессированных PcG. Более того, мы могли обогатиться кругами, генерируемыми в не репрессированных сегментах, поскольку FLP частично ингибируется репрессией PcG (Рис. 7). В любом случае эта ДНК не имеет ни более отрицательной, ни более положительной суперспирали, чем контрольная.

Чтобы создать круги исключительно из PcG-репрессированной ДНК, мы индуцировали активность FLP у взрослых мух и приготовили ДНК из голов мух, где весь BX-C должен быть неактивным.В качестве контроля мы также приготовили круги из вставки 3-й хромосомы вне BX-C (рис. 8A). Наибольшая разница, наблюдаемая между образцами, полученными через 1 час индукции FLP, была ΔLK 0,7, между контролем и линией p [Mcp]. Линия p [Mcp] была менее отрицательно скручена, что является изменением, противоположным направлению, которого мы ожидали, но мы сомневаемся, что это существенное изменение. Мы действительно видим большее количество кругов, создаваемых головками контрольных мух, чем головками вставных мушек BX-C (сравните первые две полосы на рис.8А к остальным). Это согласуется с нашим наблюдением, что репрессия PcG частично ингибирует рекомбинацию FLP у эмбрионов (Fig. 7). Однако со временем FLP, по-видимому, преодолевает репрессию PcG, что в конечном итоге приводит к восстановлению многих кругов из ДНК, репрессированной PcG. Это согласуется с результатами, полученными на дрожжах, где было показано, что скорость вырезания рекомбиназой медленнее на молчащей ДНК, но в конечном итоге тот же уровень рекомбинации достигается как на молчащей, так и на негашеной ДНК (2).

У дрожжей SIR-сайленсинг и соответствующие различия топологии на эписомах разрушаются со временем (4, 11). Мы исследовали круги, собранные сразу после 1 ч индукции FLP или после дополнительных 2 ч инкубации при комнатной температуре. Круги накапливаются из-за продолжающейся активности FLP в течение этого времени. Круги могут быть немного более положительно свернуты в среднем в более поздний момент времени, но опять же, различия невелики. Наибольшее изменение произошло в контрольной линии с ΔLK, равным 0.7. p [bx] показал ΔLK, равный 0,6, в то время как остальные вставки BX-C показали изменения менее 0,5 суперспирали. (Рис. 8A).

Мы также сравнили круги, полученные из разных сегментов мухи. Мух, содержащих контрольную 3-ю хромосому или вставки p [Mcp] или p [Abd-B], подвергали тепловому шоку для образования кругов FLP, замораживали и затем разрезали на головы, грудную клетку и брюшную полость. Большая часть или вся ДНК из голов и грудей линий p [Mcp] и p [Abd-B] должна быть репрессирована PcG, в то время как только часть клеток в брюшной полости должна быть репрессирована PcG.Не было существенной разницы в суперспирализации кругов между сегментами или между лесками. (Наибольшее изменение было между головами и брюшками контрольной линии [ΔLK 0,5; данные не показаны].)

Мы также сравнили топологию кругов, полученных от эмбрионов дикого типа или мутантных эмбрионов Polycomb. Мы приготовили рекомбинантные линии мух, содержащие источник FLP на той же хромосоме, что и нулевой аллель гена Polycomb ( Pc ³ ). Мы также подготовили рекомбинантные 3-е хромосомы, содержащие наши вставки BX-C и аллель Pc ³ . Скрещивание этих линий дает популяцию эмбрионов, в которой только нулевые гомозиготы Polycomb- будут давать круги. Мы приготовили круги из эмбрионов дикого типа со вставкой p [Mcp] и из Pc- нулевых эмбрионов со вставкой p [Mcp] или p [Abd-B]. Обратите внимание, что сегментарное ограничение lacZ теряется в отсутствие PcG для вставок p [Mcp] и p [Abd-B], но что lacZ транскрибируется в меньшем количестве клеток в Pc ³ , p [Mcp] эмбрионов (рис.4C), тогда как транскрипция активируется во многих других клетках в Pc ³ , p [Abd-B] эмбрионы (фиг. 4D). Несмотря на эти изменения, мы не видим различий в топологии кругов у эмбрионов дикого типа или мутантных эмбрионов Pc (ΔLK менее 0,5; фиг. 8B). Мы также сравнили круги, полученные от взрослых мужчин, и взрослых женщин, содержащих контрольные вставки X-хромосомы, чтобы увидеть, может ли изменение суперспирали ДНК быть связано с дозовой компенсацией мужской X-хромосомы.Опять же, мы не смогли обнаружить никакой разницы (данные не показаны).

В экспериментах с SIR-замалчивающей ДНК у дрожжей наблюдаемое изменение числа связей было пропорционально размеру круга (4). Круг размером 4,3 т.п.н., полученный из SIR-репрессированной ДНК, содержал в среднем на пять отрицательных суперспиралей больше, чем нерепрессированная ДНК из того же места. Таким образом, можно ожидать, что сопоставимая модификация в наших кругах размером 4,9 КБ приведет к изменению номера связи> 5. Возможно, что структура ДНК нарушается при образовании круга у мух.Однако нет оснований полагать, что FLP-опосредованная рекомбинация у мух должна быть более разрушительной для структуры хроматина, чем у дрожжей. Мы подвергали наши шнуры тепловому шоку, чтобы произвести FLP. Однако Ченг и др. (11) проанализировали круги, образующиеся при различных температурах, вплоть до 37 ° C, и обнаружили аналогичные различия в топологии при всех температурах. Более того, мы видим ингибирование наших датчиков доступности после теплового шока, что позволяет предположить, что репрессия PcG не затронута. Самая простая интерпретация состоит в том, что суперспирализация ДНК не изменяется в присутствии или отсутствии PcG.

Заключительные замечания. Наши анализы доступности показывают, что репрессия PcG блокирует активность активатора Gal4, рекомбиназы FLP и двух форм T7RNAP. По крайней мере, для FLP и T7RNAP не должно быть специфических взаимодействий между нашими белками-зондами и любыми белками Drosophila , участвующими в транскрипции, и, таким образом, сегмент-специфические различия в их активности должны отражать различия в их способности получать доступ к ДНК. Наши анализы не определяют точную причину блока.Ингибирование Gal4 может отражать блокировку связывания или активации. Ингибирование полимераз Т7 может отражать блокировку связывания или продвижения полимеразы по матрице ДНК. Ингибирование FLP может отражать блокировку связывания или рекомбинации ферментом. Поскольку на все три фермента влияет PcG, блокировка связывания всех трех белков кажется самым простым объяснением. Независимо от точной природы блока кажется очевидным, что существует структурное отличие ДНК, репрессированной с помощью PcG.Мы отмечаем, что две контрольные линии, использованные в этой статье, транскрипционно молчали в отсутствие Gal4, но обе обеспечивали доступ к Gal4, T7RNAP, полимеразе Голиафа и FLP по всему эмбриону. Если контроли представляют собой «типичную» конфигурацию хроматина, наши результаты предполагают, что ДНК, репрессированная с помощью PcG, менее доступна, чем в среднем. Это предполагает, что PcG не просто предотвращает нацеливание позитивных комплексов ремоделирования хроматина на ДНК.

Различия в доступности наблюдались на пяти разных сайтах с BX-C, которые лежат в очень разных контекстах (один в промоторе, другой в границе, третий в интроне и т. Д.).). Мы отмечаем, что наши сайты p [bx], p [bxd], p [iab-4] и p [Mcp] все находятся в непосредственной близости от областей связывания Polycomb, как определено исследованиями поперечного связывания Strutt et al. (49). Однако наш p [Abd-B] не попадает в PRE ни по этому критерию, ни по любому другому критерию. Поскольку он находится ниже по течению от промоутера, мы можем ожидать, что он будет более доступным, чем другие сайты в BX-C. p [Abd-B], однако, ведет себя аналогично другим нашим вставкам BX-C. Мы отмечаем, что хоминг не нацелен на вставки P исключительно в предполагаемые сайты связывания PcG (3).Более того, опосредованная PcG репрессия транскрипции lacZ наблюдалась для многих других вставок в BX-C, удаленных от предполагаемых сайтов связывания PcG (3, 30). Объединенные результаты наших пяти сайтов тестирования доступности предполагают, что PcG вызывает снижение доступности на больших непрерывных участках ДНК. Это может происходить напрямую, покрывая хромосому, или косвенно, путем модификации нуклеосом. Тот факт, что T7RNAP оказывается более чувствительным к репрессии PcG в нашей кассете, содержащей UAS-TATA, чем к простым вставкам (посредством преобразования гена) промотора T7 (29), может предполагать, что репрессия PcG может не функционировать одинаково на всех сайтах в BX-C.Более того, наши результаты не исключают возможность того, что большой мультипротеиновый комплекс PcG играет несколько ролей, возможно, опосредуя промотор-специфические эффекты в дополнение к более широко распространенному эффекту хроматина. Наши результаты с полимеразой Голиафа на простой вставке промотора Т7, однако, утверждают, что PcG должна взаимодействовать с последовательностями, удаленными от областей промотора Pol II.

Повышенная чувствительность полимеразы Голиафа предполагает, что блок, созданный PcG, может быть более эффективным против более крупных молекул или комплексов.Большие активационные комплексы, такие как комплекс SWI-SNF, являются очевидными кандидатами на роль мишеней Polycomb. Действительно, Shao et al. (44) продемонстрировали in vitro, что комплекс PRC1, содержащий Polycomb, блокирует ремоделирование хроматина с помощью комплекса SWI-SNF млекопитающих. Их анализ измерял изменения в суперспирали кольцевой матрицы ДНК. Было показано, что SWI-SNF способен создавать в среднем ΔLK ∼ + 0,32 на нуклеосому in vitro (23). Сходным образом, подавление SIR, как было показано, связано с ΔLK величиной ∼ -0.36 на нуклеосому, предполагая, что 1 нуклеосома на 216 п.н. ДНК (4). Ожидается, что наши круги размером 4,9 т.п.н. вмещают около 22 нуклеосом. Если бы ремоделирование хроматина было ограничено одной или несколькими нуклеосомами, охватывающими промоторную область наших конструкций, мы могли бы не обнаружить изменения плотности суперспирали. Ясно, однако, что широко распространенное ремоделирование нуклеосом, подобное тому, что наблюдается с комплексом SIR in vivo или, действительно, с SWI-SNF in vitro, не может объяснить сегмент-специфические различия в доступности ДНК BX-C.

Активные и репрессированные домены хроматина демонстрируют отчетливую сегрегацию нуклеосом во время репликации ДНК

Основные моменты

•

Система биотинилирования CRISPR для отслеживания сегрегации родительских нуклеосом в одном локусе

15 зависимая от гистона 9

нуклеосомы исключительно в G1 / S

•

Родительские нуклеосомы локально переотложены в репрессированных доменах хроматина

•

Родительские нуклеосомы рассредоточиваются в случае активных доменов хроматина

Резюме

структуры должны быть точно унаследованы через клеточное деление, чтобы поддерживать клеточную идентичность.Однако доступ к локализованным стратегиям, сохраняющим наследование хроматинового домена, особенно к переносу родительских, ранее существовавших нуклеосом с их ассоциированными посттрансляционными модификациями (PTM) во время репликации ДНК, является сложной задачей в живых клетках. Мы разработали индуцибельную, зависимую от близости систему мечения для необратимой маркировки зависимых от репликации гистон-содержащих h4.1 и h4.2 нуклеосом в желаемых локусах в эмбриональных стволовых клетках мыши, чтобы можно было проследить их судьбу после репликации ДНК.

Поразительно, что репрессированные домены хроматина сохраняются за счет локального повторного отложения родительских нуклеосом. Напротив, нуклеосомы, украшающие активные домены хроматина, не обладают такой сохранностью. Примечательно, что изменение клеточной судьбы ведет к корректировке позиционного наследования родительских нуклеосом, что отражает соответствующие изменения в структуре хроматина. Эти находки указывают на важные механизмы, которые вносят вклад в сегрегацию родительских нуклеосом для сохранения клеточной идентичности.

Ключевые слова

посттрансляционные модификации гистонов

эпигенетические

репрессированные домены хроматина

подавление гена

экспрессия гена

polycomb

сегрегация родительских нуклеосом

репликация ДНК

© 2019 Elsevier Inc.

Рекомендуемые статьи

Цитирование статей

Подавляют ли американские опросы «молчаливое большинство»? — Валдайский клуб

Американская президентская кампания вот-вот начнется по-настоящему. Последние шесть месяцев были особенно нестабильными и мучительными: хаос и беспорядки, вызванные пандемией коронавируса, мобилизацией социальных движений вокруг вопросов расовой идентичности и дискуссиями о культуре отмены и политической корректности.Как на этом фоне интерпретировать данные опросов по ноябрьским президентским выборам? Джон Роговски, доцент кафедры государственного управления Гарвардского университета, обсуждает доказательства в поддержку утверждений о том, что «молчаливое большинство» спасет шансы президента Трампа на переизбрание.

В этом месяце две основные политические партии Америки собрались — конечно, дистанционно, учитывая пандемию, — чтобы официально выдвинуть своих кандидатов на посты президента и вице-президента.Современные партийные съезды — это больше празднование, чем обсуждение, в основном они призваны взволновать сторонников партии и привлечь внимание средств массовой информации к кандидатам от каждой партии. Хотя от съездов, скорее всего, будет поступать мало примечательных новостей, их завершение в ночь на 27 августа знаменует традиционное начало осеннего сезона кампании. С этого момента кампания за президентство начинается всерьез.

Этот график может удивить некоторых наблюдателей. В конце концов, президентская кампания 2020 года была одной из самых продолжительных в истории Америки.Два демократа заявили о своих кандидатурах в президенты еще в 2017 году, а 26 других позже присоединились к ним в борьбе за выдвижение от Демократической партии. Что касается республиканцев, то президент Дональд Трамп официально начал свою кампанию по переизбранию летом 2019 года. Тем не менее, многие американцы не следят внимательно за политикой, и американцы, чьи голоса могут иметь наиболее важное значение для определения исхода выборов этой осенью, возможно, еще не дали многого думал кого поддержат.

Однако то, что все американцы ревностно не следят за электоральной политикой, не означает, что социологи не пытаются измерить свои политические взгляды.Фактически, мы наводнены данными об общественном мнении. Почти каждый день новые заголовки объявляют результаты последнего опроса, призванного оценить состояние президентской гонки. В течение последнего года Джо Байден неизменно лидировал в опросах Дональда Трампа с отрывом от четырех до одиннадцати процентных пунктов.

Что мы должны делать с опросами, проведенными к этому моменту в избирательном цикле? Когда американцы снова начнут настраиваться на президентскую гонку, выдержат ли эти опросы, когда они будут поданы? Две точки зрения предлагают руководство по интерпретации опросов на выборах 2020 года.С одной стороны, опросы последних президентских выборов становились все более точными. Опросы обычно становятся более точными после сезона съездов — примерно там, где мы находимся сегодня. И национальные опросы, проведенные в 2016 году, были точнее, чем когда-либо в истории современных опросов.

С другой стороны, многие социологи ошибочно прогнозируют, что на президентских выборах 2016 года победит Хиллари Клинтон, а не Дональд Трамп. (Обратите внимание, однако, что Клинтон действительно выиграла всенародное голосование, что и предсказывают национальные опросы.) Тем не менее, у некоторых этот просчет подогревает скептицизм по отношению к результатам опроса. Вместо этого некоторые утверждают, что опросы неверно оценивают состояние президентских выборов 2020 года из-за наличия «застенчивых избирателей Трампа». Это утверждение предполагает, что избиратели, которые намереваются поддержать Трампа, искажают свою поддержку его, когда с ними связываются социологи, или же отказываются от возможности участвовать в опросах. Ранее в этом месяце президент Трамп сам ухватился за утверждение о «застенчивом избирателе Трампа», чтобы утверждать, что он пользуется поддержкой «молчаливого большинства», подобного которому никто не видел.”

На первый взгляд утверждение о том, что поддержка Трампа превышает то, что показывают опросы, не может быть диковинным. Исторические данные указывают на другие контексты, в которых опросы неверно характеризовали фактический уровень поддержки кандидатов. Например, опросы исторически преувеличивали поддержку кандидатов-афроамериканцев, которые баллотировались против белых кандидатов. Несоответствие объясняется предвзятостью социальной желательности, когда респонденты переоценивают свои взгляды и убеждения, которые считаются желательными.Например, респонденты опроса, поддерживающие белого кандидата, могут не желать, чтобы их считали расистами, и поэтому они сообщают социологам (неверно), что намерены голосовать за кандидата афроамериканцев. Сегодняшние дискуссии о «культуре отмены», политической корректности и растущей значимости расы и идентичности могут заставить сторонников Трампа опасаться, что выражение своих взглядов приведет к социальному остракизму.

Разумеется, существуют анекдоты, отражающие эти опасения, отдельные избиратели, выражающие эти опасения.И в избирательном цикле 2016 года несколько отдельных опросов подтвердили этот тезис, в котором поддержка Трампа была выше, когда опросы проводились онлайн, а не в режиме реального времени. Тем не менее, независимые исследования, проведенные отдельными исследователями и с использованием разных методологий, содержат мало свидетельств того, что избирательные опросы систематически настроены против Трампа. Напротив, наиболее вероятным объяснением неожиданной победы Трампа на выборах в 2016 году является то, что избиратели, принявшие решение о голосовании на очень поздних этапах избирательного цикла, сделали это таким образом, который оказался в его пользу.Успех Трампа был обусловлен не столько недостаточной представленностью его сторонников в опросах, сколько его эффективностью в обращении избирателей, поздно принявших решение.

Неоднократное заявление Трампа о том, что его поддерживает «молчаливое большинство», не вызывает особого удивления, несмотря на доказательства обратного. За последние полвека американские политики часто использовали общую тактику, когда общественное мнение, кажется, не поддерживает их точку зрения: спорите с мерами! Президент Ричард Никсон впервые применил концепцию своего «молчаливого большинства» в 1969 году, утверждая, что небольшое количество громких протестующих против войны во Вьетнаме меркнет по сравнению с большинством американцев, выступавших против антивоенных демонстраций.Президенты Рейган, Клинтон и Обама также обращались с призывами к американцам, чьи взгляды, как они утверждают, нечасто представлены, но обычно разделяются.

Таким образом, утверждение о том, что молчаливое большинство спасет избирательные позиции Трампа, является скорее политическим театром, чем политической реальностью. Когда опросы не в пользу вашей кампании, вы идете против них. Трамп снова прибегает к этой проверенной временем стратегии, как и в 2016 году. Это попытка заявить о своей легитимности, несмотря на доказательства обратного.

Предостережение ко всему этому, конечно же, заключается в том, что 2020 год не является нормальным годом президентских выборов. Пандемия коронавируса коренным образом изменит то, как американцы будут голосовать. Это также может повлиять на то, будут ли американцы голосовать вообще — и будут ли эти бюллетени в конечном итоге подсчитаны. Таким образом, несмотря на все достижения в области современных опросов, прогнозирование результатов выборов 2020 года является более сложной задачей, чем это было за последние десятилетия. Но несмотря на все чернила, пролитые на культурных различиях в американской политике, мало доказательств того, что молчаливое большинство готово спасти президента Трампа от первого поражения действующего президента за 28 лет.

Преодоление творческих блоков — Шелли Кламмер

Заблокированные эмоции

Если вы чувствуете, что творчески заблокированы, то, что стоит между вами и вашим радостным творчеством, — это ваша непризнанная эмоциональная боль. Многие из нас обладают слоями эмоциональной боли, с которыми мы еще не могли сознательно столкнуться. В этом нет ничего постыдного. Это наше человеческое состояние.

Некоторые из нас, чувствительные в душе и сочувствующие другим, не могут вспомнить никаких очевидных травм в детстве, чтобы точно определить, почему мы так страдаем.Тем не менее, когда мы взрослые, загадочным образом мы чувствуем безымянную тревогу, депрессию, горе, страх и гнев, путешествуя по повседневной жизни.

Необработанные эмоции часто возникают в повседневной жизни, чтобы их можно было принять, полюбить и принять, но часто мы игнорируем сигналы. Каждый раз, когда вы ловите себя на задержке дыхания, например, вы подавляете эмоцию. Каждый раз, когда вы чувствуете какое-то напряжение в своем теле, вы зажимаете что-то, что нужно исцелить.

Прежде чем мы станем свободными и радостными творцами, мы должны позволить нашим творческим блокам вести нас в направлении исцеления, в котором они хотят, чтобы мы шли.Наши творческие блоки всегда требуют включения наших подавленных эмоций. Не убежать от болезненных эмоций — это смелый поступок.

Как взрослые, мы не можем ожидать, что другие будут любить нас так, как мы не любим самих себя. Обращение к нашим трудным чувствам с любовью и любопытством создает свободную и сильную жизнь. Приглашение к любви к подавленным эмоциям высвобождает новую энергию и открывает портал в творческий разум, к которому мы, возможно, не имели доступа с детства.

Очистка творческих блоков

До тех пор, пока мы не объединим все эмоции, которые не могли обработать в детстве, мы будем ходить, как дети, во взрослых телах. Многие из нас редко исследуют детские убеждения, с помощью которых мы фильтруем свое восприятие мира.

Мы остаемся неизменными в убеждениях, которые были заложены в молодости. В детстве мы эмоционально накладываем отпечаток на эмоциональные паттерны наших родителей. Рожденные открытыми, как губка, мы принимаем на себя всю тяжесть эмоционального мира нашего опекуна.

Духовный учитель Майкл Браун объясняет, как наш внутренний ребенок живет внутри нашего взрослого тела:

«Экспериментально именно в первые семь лет все неприятные переживания, возникающие в результате нашего вхождения в условный мир, запечатлеваются и влияют на состояние нашего эмоционального тела. Таким образом, наше эмоциональное тело является тем местом, где хранятся записи этих событий. . »

Дети буквально впитывают «эмоционально-болевой суп» вокруг себя. Я помню один случай, много лет назад, когда заметил точную корреляцию моей эмоциональности с эмоциональностью дочери.

Моя четырехлетняя дочь купалась в нашей старой ванне на ножках. Я сидел на диване в гостиной неподалеку. В доме было тихо, и внезапно я почувствовал пронзительное одиночество в моем сердце. В тот же момент моя дочь закричала: «Мама! Мое ​​сердце вываливается из груди от одиночества!»

Попытки связать наши дискомфортные чувства с конкретной травмой из детства или поиск детской истории жестокого обращения, чтобы объяснить нашу эмоциональную боль, часто слишком упрощены.Мы страдаем от предков за всех, кто был до нас. Мы наследуем боль тех членов нашей семьи, которые не знали, как справиться со своей эмоциональной болью.

Сильное присутствие эмоциональной боли

Эмоциональная боль может нас одолеть. Эмоциональная боль может быть настолько сильной, что мы едва ли способны думать, функционировать, работать или общаться с другими людьми. В таком дискомфорте легко думать, что мы должны избавиться от своей боли, обвиняя в ней других, тогда как вместо этого нам нужно научиться расширять свое любящее присутствие до нее.

Мы выполняем работу любящего присутствия, осознавая нашу эмоциональную боль, сначала слегка касаясь ее, и делая перерывы, когда она кажется слишком невыносимой. По мере того, как мы становимся более самолюбивыми с нашим добрым внутренним вниманием, боль проходит через наше существо с большей скоростью, пока в один прекрасный день не пройдет.

Lsh регулирует репрессию ретротранспозона LTR независимо от функции Dnmt3b | Genome Biology

1.

Reddington JP, Pennings S, Meehan RR: Неканонические функции метилома ДНК в регуляции генов.Biochem J. 2013, 451: 13-23. 10.1042 / BJ20121585.

PubMed CAS Статья Google Scholar

2.

Meissner A, Mikkelsen TS, Gu H, Wernig M, Hanna J, Sivachenko A, Zhang X, Bernstein BE, Nusbaum C, Jaffe DB, Gnirke A, Jaenisch R, Lander ES: Метилирование ДНК в масштабе генома карты плюрипотентных и дифференцированных клеток. Природа. 2008, 454: 766-770.

PubMed CAS PubMed Central Google Scholar

3.

Листер Р., Пелиццола М., Доуэн Р., Хокинс Р. Д., Хон Дж., Тонти-Филиппини Дж., Нери Дж. Р., Ли Л., Йе З, Нго К. М., Эдсалл Л., Антосевич-Бурже Дж., Стюарт Р., Руотти В., Миллар А. Х., Томсон Дж. А., Рен Б., Эккер Дж. Р.: Метиломы ДНК человека при базовом разрешении демонстрируют широко распространенные эпигеномные различия. Природа. 2009, 462: 315-322. 10.1038 / природа08514.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

4.

Li E, Bestor TH, Jaenisch R: Нацеленная мутация гена ДНК-метилтрансферазы приводит к гибели эмбрионов.Клетка. 1992, 69: 915-926. 10.1016 / 0092-8674 (92) -Ф.

PubMed CAS Статья Google Scholar

5.

Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E: ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a и Dnmt3b необходимы для метилирования de novo и развития млекопитающих. Клетка. 1999, 99: 247-257. 10.1016 / S0092-8674 (00) 81656-6.

PubMed CAS Статья Google Scholar

6.

Qin W, Leonhardt H, Pichler G: Регулирование ДНК-метилтрансферазы 1 посредством взаимодействий и модификаций. Ядро. 2011, 2: 392-402. 10.4161 / nucl.2.5.17928.

PubMed Статья Google Scholar

7.

Шариф Дж., Муто М, Такебаяши С.И., Суетакэ I, Ивамацу А, Эндо Т.А., Шинга Дж., Мизутани-Косеки Й., Тойода Т, Окамура К., Таджима С., Мицуя К., Окано М, Косеки Х: Белок SRA Np95 опосредует эпигенетическое наследование путем рекрутирования Dnmt1 на метилированную ДНК.Природа. 2007, 450: 908-912. 10.1038 / природа06397.

PubMed CAS Статья Google Scholar

8.

Джарвис С.Д., Гейман Т., ВилаСторм М.П., ​​Осипович О., Акелла Ю., Кандейас С., Натан И., Дурум С.К., Муэгге К. Новая предполагаемая геликаза, продуцируемая в ранних лимфоцитах мыши. Ген. 1996, 169: 203-207. 10.1016 / 0378-1119 (95) 00843-8.

PubMed CAS Статья Google Scholar

9.

Geiman TM, Tessarollo L, Anver MR, Kopp JB, Ward JM, Muegge K: Lsh, член семейства SNF2, необходим для нормального развития мышей. Biochim Biophys Acta. 2001, 1526: 211-220. 10.1016 / S0304-4165 (01) 00129-5.

PubMed CAS Статья Google Scholar

10.

Sun LQ, Lee DW, Zhang QG, Xiao WH, Raabe EH, Meeker A, Miao DS, Huso DL, Arceci RJ: Фенотипы замедления роста и преждевременного старения у мышей с нарушением SNF2-подобного гена, PASG. Genes Dev. 2004, 18: 1035-1046. 10.1101 / гад.1176104.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

11.

Xi SC, Zhu HM, Xu H, Schmidtmann A, Geiman TM, Muegge K: Lsh контролирует молчание гена Hox во время развития. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007, 104: 14366-14371. 10.1073 / pnas.0703669104.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

12.

Brzeski J, Jerzmanowski A: Дефицит метилирования ДНК 1 (DDM1) определяет новое семейство факторов ремоделирования хроматина. J Biol Chem. 2003, 278: 823-828. 10.1074 / jbc.M209260200.

PubMed CAS Статья Google Scholar

13.

Flaus A, Owen-Hughes T: Механизмы АТФ-зависимого ремоделирования хроматина: средства достижения цели. Фебс Дж. 2011, 278: 3579-3595. 10.1111 / j.1742-4658.2011.08281.x.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

14.

Burrage J, Termanis A, Geissner A, Myant K, Gordon K, Stancheva I. АТФаза LSH семейства SNF2 способствует фосфорилированию h3AX и эффективному восстановлению двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих. J Cell Sci. 2012, 125: 5524-5534. 10.1242 / jcs.111252.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

15.

Гендрел А.В., Липпман З., Йордан С., Колот В., Мартиенсен Р.А.: Зависимость паттернов метилирования гетерохроматического гистона h4 от гена арабидопсиса DDM1.Наука. 2002, 297: 1871-1873. 10.1126 / science.1074950.

PubMed CAS Статья Google Scholar

16.

Земах А., Ким М.Ю., Сие PH, Коулман-Дерр Д., Эшед-Вильямс Л., Тао К., Хармер С.Л., Зильберман Д.: Ремоделирующий нуклеосомы арабидопсиса DDM1 позволяет ДНК-метилтрансферазам получать доступ к h2-содержащему гетерохроматину. Клетка. 2013, 153: 193-205. 10.1016 / j.cell.2013.02.033.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

17.

Crichton JH, Dunican DS, Maclennan M, Meehan RR, Adams IR: Защита генома от врага внутри: механизмы подавления ретротранспозона в зародышевой линии мыши. Cell Mol Life Sci. 2013, [Epub до печати]

Google Scholar

18.

Hackett JA, Reddington JP, Nestor CE, Dunican DS, Branco MR, Reichmann J, Reik W., Surani MA, Adams IR, Meehan RR: Метилирование промоторной ДНК связывает механизмы защиты генома с эпигенетическим репрограммированием у мышей зародышевая линия.Разработка. 2012, 139: 3623-3632. 10.1242 / dev.081661.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

19.

Ollinger R, Childs AJ, Burgess HM, Speed ​​RM, Lundegaard PR, Reynolds N, Gray NK, Cooke HJ, Adams IR: Удаление гена Tex19.1, связанного с плюрипотентностью, вызывает активацию эндогенных ретровирусов и дефектных сперматогенез у мышей. PLoS Genet. 2008, 4: e1000199-10.1371 / journal.pgen.1000199.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

20.

Reichmann J, Reddington JP, Best D, Read D, Ollinger R, Meehan RR, Adams IR: ген защиты генома Tex19.1 подавляет ретротранспозоны LINE-1 в плаценте и предотвращает задержку внутриутробного роста у мышей. Hum Mol Genet. 2013, 22: 1791-1806. 10.1093 / hmg / ddt029.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

21.

Максакова И.А., Romanish MT, Gagnier L, Dunn CA, de Lagemaat LNV, Mager DL: Ретровирусные элементы и их хозяева: инсерционный мутагенез в зародышевой линии мыши. PLoS Genet. 2006, 2: 1-10. 10.1371 / journal.pgen.0020001.

CAS Статья Google Scholar

22.

Reichmann J, Crichton JH, Madej MJ, Taggart M, Gautier P, Garcia-Perez JL, Meehan RR, Adams IR: анализ микроматрицы сайленсинга ретротранспозона LTR идентифицирует Hdac1 как регулятор экспрессии ретротранспозона в эмбриональном стволе мыши клетки.PLoS Comput Biol. 2012, 8: e1002486-10.1371 / journal.pcbi.1002486.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

23.

Guenatri M, Bailly D, Maison C, Almouzni G: Мыши-центрические и перицентрические сателлитные повторы образуют отдельный функциональный гетерохроматин. J Cell Biol. 2004, 166: 493-505. 10.1083 / jcb.200403109.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

24.

Walsh CP, Bestor TH: метилирование цитозина и развитие млекопитающих. Genes Dev. 1999, 13: 26-34. 10.1101 / gad.13.1.26.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

25.

Киши Y, Кондо S, Gotoh Y: Активация транскрипции основных сателлитных областей мыши во время дифференцировки нейронов. Функция сотовой структуры. 2012, 37: 101-110. 10.1247 / csf.12009.

PubMed CAS Статья Google Scholar

26.

Probst AV, Okamoto I, Casanova M, El Marjou F, Le Baccon P, Almouzni G: специфичный для цепи всплеск транскрипции перицентрических сателлитов необходим для образования хромоцентров и раннего развития мышей. Dev Cell. 2010, 19: 625-638. 10.1016 / j.devcel.2010.09.002.

PubMed CAS Статья Google Scholar

27.

Ting DT, Lipson D, Paul S, Brannigan BW, Akhavanfard S, Coffman EJ, Contino G, Deshpande V, Iafrate AJ, Letovsky S, Rivera MN, Bardeesy N, Maheswaran S, Haber DA: аберрантное избыточное выражение сателлитных повторов при раке поджелудочной железы и других эпителиальных опухолях. Наука. 2011, 331: 593-596. 10.1126 / science.1200801.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

28.

Tao YG, Xi SC, Shan JG, Maunakea A, Che A, Briones V, Lee EY, Geiman T, Huang JQ, Stephens R, Leighty RM, Zhao KJ, Muegge K: Lsh, семейство ремоделирования хроматина член, модулирует паттерны метилирования цитозина по всему геному в неповторяющихся последовательностях. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2011, 108: 5626-5631. 10.1073 / pnas.1017000108.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

29.

Myant K, Termanis A, Sundaram AYM, Boe T, Li C, Merusi C, Burrage J, de Las Heras JI, Stancheva I: LSH и комплекс G9a / GLP необходимы для запрограммированного в процессе развития метилирования ДНК. Genome Res. 2011, 21: 83-94. 10.1101 / gr.108498.110.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

30.

Xi S, Geiman TM, Briones V, Guang TY, Xu H, Muegge K: Lsh участвует в метилировании ДНК и подавлении генов стволовых клеток. Стволовые клетки. 2009, 27: 2691-2702. 10.1002 / стержень.183.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

31.

Zhu HM, Geiman TM, Xi SC, Jiang Q, Schmidtmann A, Chen TP, Li E, Muegge K: Lsh участвует в метилировании ДНК de novo. EMBO J. 2006, 25: 335-345. 10.1038 / sj.emboj.7600925.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

32.

Oda M, Glass JL, Thompson RF, Mo YK, Olivier EN, Figueroa ME, Selzer RR, Richmond TA, Zhang XM, Dannenberg L, Green RD, Melnick A, Hatchwell E, Bouhassira EE, Verma A , Suzuki M, Greally JM: Профилирование метилирования цитозина по всему геному с высоким разрешением с одновременным анализом числа копий и оптимизацией для ограниченного числа клеток. Nucleic Acids Res.2009, 37: 3829-3839. 10.1093 / нар / gkp260.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

33.

Reddington JP, Perricone SM, Nestor CE, Reichmann J, Youngson NA, Suzuki M, Reinhardt D, Dunican DS, Prendegast JG, Mjoseng H, Ramsahoye BH, Whitelaw E, Greally JM, Adams IR, Bickmore WA , Meehan RR: Перераспределение h4K27me3 при гипометилировании ДНК приводит к дерепрессии генов-мишеней Polycomb. Genome Biol.2013, 14: R25-10.1186 / gb-2013-14-3-r25.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

34.

Nair SS, Coolen MW, Stirzaker C, Song JZ, Statham AL, Strbenac D, Robinson MD, Clark SJ: Сравнение иммунопреципитации метил-ДНК (MeDIP) и захвата белка связывающего домена метил-CpG (MBD) для анализа метилирования ДНК по всему геному выявляют систематическую ошибку покрытия последовательности CpG. Эпигенетика. 2011, 6: 34-44. 10.4161 / epi.6.1.13313.

PubMed CAS Статья Google Scholar

35.

McLellan AS, Dubin RA, Jing Q, Broin PO, Moskowitz D, Suzuki M, Calder RB, Hargitai J, Golden A, Greally JM: Система Wasp: среда с открытым исходным кодом для управления и анализа геномных данных . Геномика. 2012, 100: 345-351. 10.1016 / j.ygeno.2012.08.005.

PubMed CAS Статья Google Scholar

36.

Bowtie: сверхбыстрый выравниватель для короткого считывания с эффективным использованием памяти. URL: http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml

37.

Huang JQ, Fan T, Yan QS, Zhu HM, Fox S, Issaq HJ, Best L, Gangi L, Munroe D, Muegge K: Lsh, эпигенетический хранитель повторяющихся элементов. Nucleic Acids Res. 2004, 32: 5019-5028. 10.1093 / нар / гх821.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

38.

Ueda Y, Okano M, Williams C, Chen TP, Georgopoulos K, Li E: Роли Dnmt3b в развитии млекопитающих: мышиная модель синдрома ICF.Разработка. 2006, 133: 1183-1192. 10.1242 / dev.02293.

PubMed CAS Статья Google Scholar

39.

Gaudet F, Rideout WM, Meissner A, Dausman J, Leonhardt H, Jaenisch R: Экспрессия Dnmt1 в пре- и постимплантационном эмбриогенезе и поддержание молчания IAP. Mol Cell Biol. 2004, 24: 1640-1648. 10.1128 / MCB.24.4.1640-1648.2004.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

40.

Като Ю., Канеда М., Хата К., Кумаки К., Хисано М., Кохара Ю., Окано М., Ли Е., Нозаки М., Сасаки Н.: Роль семейства Dnmt3 в метилировании de novo импринтированных и повторяющихся последовательностей во время развития мужских половых клеток в мышке. Hum Mol Genet. 2007, 16: 2272-2280. 10.1093 / hmg / ddm179.

PubMed CAS Статья Google Scholar

41.

Walsh CP, Chaillet JR, Bestor TH: Транскрипция эндогенных ретровирусов IAP ограничена метилированием цитозина.Нат Жене. 1998, 20: 116-117. 10.1038 / 2413.

PubMed CAS Статья Google Scholar

42.

TopHat: преобразователь чтения для RNA-Seq. URL: http://tophat.cbcb.umd.edu/

43.

Galaxy Public Server. 2013, [https://main.g2.bx.psu.edu/]

44. Проект программирования на R

. 2013, [http://www.r-project.org]

45.

Пакет EdgeR. 2013 г., [http: //www.bioconductor.org / packages / 2.11 / bioc / html / edgeR.html]

46.

Карими М.М., Гоял П., Максакова И.А., Биленки М., Леунг Д., Тан Дж. Х., Шинкай Ю., Магер Д. Л., Джонс С., Херст М., Lorincz MC: Метилирование ДНК и SETDB1 / h4K9me3 регулируют преимущественно различные наборы генов, ретроэлементов и химерных транскриптов в mESC. Стволовая клетка. 2011, 8: 676-687. 10.1016 / j.stem.2011.04.004.

PubMed CAS Статья Google Scholar

47.

Puech A, Dupressoir A, Loireau MP, Mattei MG, Heidmann T: Характеристика двух индуцированных возрастом транскриптов, связанных с интрацистернальными А-частицами, в печени мыши — считывание транскрипции в открытую рамку считывания, сходную с транскрипцией дрожжевого CCR4 фактор. J Biol Chem. 1997, 272: 5995-6003. 10.1074 / jbc.272.9.5995.

PubMed CAS Статья Google Scholar

48.

Dewannieux M, Dupressoir A, Harper F, Pierron G, Heidmann T: Идентификация автономных ретротранспозонов IAP LTR, подвижных в клетках млекопитающих.Нат Жене. 2004, 36: 534-539. 10.1038 / ng1353.

PubMed CAS Статья Google Scholar

49.

Рибет Д., Харпер Ф, Дюпрессуар А, Деваннье М., Пьерон Дж., Хайдманн Т.: Инфекционный предшественник ретротранспозона IAP мыши: возникновение внутриклеточного генетического паразита из древнего ретровируса. Genome Res. 2008, 18: 597-609. 10.1101 / gr.073486.107.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

50.

Jenuwein T, Allis CD: Перевод гистонового кода. Наука. 2001, 293: 1074-1080. 10.1126 / science.1063127.

PubMed CAS Статья Google Scholar

51.

Martens JHA, O’Sullivan RJ, Braunschweig U, Opravil S, Radolf M, Steinlein P, Jenuwein T: профиль состояний метилирования гистонового лизина, связанного с повтором, в эпигеноме мыши. Эмбо Дж. 2005, 24: 800-812. 10.1038 / sj.emboj.7600545.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

52.

Freitag M, Hickey PC, Khlafallah TK, Read ND, Selker EU: HP1 необходим для метилирования ДНК в Neurospora. Mol Cell. 2004, 13: 427-434. 10.1016 / S1097-2765 (04) 00024-3.

PubMed CAS Статья Google Scholar

53.

Yan QS, Huang JQ, Fan T, Zhu HM, Muegge K: Lsh, модулятор метилирования CpG, имеет решающее значение для нормального метилирования гистонов. Embo J. 2003, 22: 5154-5162. 10.1093 / emboj / cdg493.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

54.

Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J, Fry B, Meissner A, Wernig M, Plath K, Jaenisch R, Wagschal A, Feil R, Schreiber SL, Lander ES: двухвалентная структура хроматина отмечает ключевые гены развития в эмбриональных стволовых клетках. Клетка. 2006, 125: 315-326. 10.1016 / j.cell.2006.02.041.

PubMed CAS Статья Google Scholar

55.

Borgel J, Guibert S, Li Y, Chiba H, Schubeler D, Sasaki H, Forne T., Weber M: Цели и динамика метилирования промоторной ДНК во время раннего развития мышей.Нат Жене. 2010, 42: 1093-1100. 10.1038 / нг.708.

PubMed CAS Статья Google Scholar

56.

Сейзенбергер С., Эндрюс С., Крюгер Ф., Аранд Дж., Уолтер Дж., Сантос Ф., Попп С., Тьенпонт Б., Дин В., Рейк В. Динамика перепрограммирования метилирования ДНК по всему геному в первичных зародышевых клетках мыши . Mol Cell. 2012, 48: 849-862. 10.1016 / j.molcel.2012.11.001.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

57.

Nishiyama A, Yamaguchi L, Sharif J, Johmura Y, Kawamura T., Nakanishi K, Shimamura S, Arita K, Kodama T., Ishikawa F, Koseki H, Nakanishi M: Uhrf1-зависимые пары убиквитилирования h4K23 поддерживают метилирование и репликацию ДНК. Природа. 2013, 502: 249-253. 10.1038 / природа12488.

PubMed CAS Статья Google Scholar

58.

Деннис К., Фан Т., Гейман Т., Ян К., Муэгге К.: Lsh, член семейства SNF2, необходим для метилирования всего генома.Genes Dev. 2001, 15: 2940-2944. 10.1101 / gad.929101.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

59.

Михан Р.Р., Пеннингс С., Станчева И.: Наращивание метилирования ДНК, вилки ремоделирования хроматина. Genes Dev. 2001, 15: 3231-3236. 10.1101 / гад.954901.

PubMed CAS Статья Google Scholar

60.

Робинсон М.Д., Стирзакер С., Стэтхэм А.Л., Кулен М.В., Сонг Дж.З., Наир С.С., Стрбенак Д., Спид Т.П., Кларк С.Дж.: Оценка данных метилирования ДНК на основе аффинности по всему геному: влияние плотности CpG, смещение амплификации и вариация числа копий.Genome Res. 2010, 20: 1719-1729. 10.1101 / gr.110601.110. Ошибка в Genome Res 2011, 21: 146

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

61.

Bourc’his D, Bestor TH: Мейотическая катастрофа и реактивация ретротранспозона в мужских половых клетках, лишенных Dnmt3L. Природа. 2004, 431: 96-99. 10.1038 / природа02886.

PubMed Статья Google Scholar

62.

Brinkman AB, Gu HC, Bartels SJJ, Zhang YY, Matarese F, Simmer F, Marks H, Bock C, Gnirke A, Meissner A, Stunnenberg HG: последовательное секвенирование ChIP-бисульфита позволяет проводить прямое исследование метилирования хроматина и ДНК в масштабе генома перекрестный разговор. Genome Res. 2012, 22: 1128-1138. 10.1101 / гр.133728.111.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

63.

Fisher CL, Fisher AG: Состояние хроматина в плюрипотентных, дифференцированных и перепрограммированных клетках.Curr Opin Genet Dev. 2011, 21: 140-146. 10.1016 / j.gde.2011.01.015.

PubMed CAS Статья Google Scholar

64.

Puschendorf M, Terranova R, Boutsma E, Mao XH, Isono KI, Brykczynska U, Kolb C, Otte AP, Koseki H, Orkin SH, van Lohuizen M, Peters AHFM: PRC1 и Suv39h указывают родительскую асимметрию в конститутивный гетерохроматин в ранних эмбрионах мыши. Нат Жене. 2008, 40: 411-420. 10.1038 / нг.99.

PubMed CAS Статья Google Scholar

65.

Sampath SC, Marazzi I, Yap KL, Krutchinsky AN, Mecklenbrauker I, Viale A, Rudensky E, Zhou MM, Chait BT, Tarakhovsky A: Метилирование гистонового миметика внутри гистон-метилтрансферазы G9a регулирует сборку белкового комплекса. Mol Cell. 2007, 27: 596-608. 10.1016 / j.molcel.2007.06.026.

PubMed CAS Статья Google Scholar

66.

Matsui T, Leung D, Miyashita H, Maksakova IA, Miyachi H, Kimura H, Tachibana M, Lorincz MC, Shinkai Y: Для подавления провирусов в эмбриональных стволовых клетках требуется гистоновая метилтрансфераза ESET.Природа. 2010, 464: 927-931. 10.1038 / природа08858.

PubMed CAS Статья Google Scholar

67.

Martin SL, Li WLP, Furano A, Boissinot S: структуры элементов L1 мыши и человека отражают механизм их вставки. Cytogenet Genome Res. 2005, 110: 223-228. 10.1159 / 000084956.

PubMed CAS Статья Google Scholar

68.

Todaro GJ, Green H: Количественные исследования роста клеток эмбриона мыши в культуре и их развития в устоявшиеся линии.J Cell Biol. 1963, 17: 299-313. 10.1083 / jcb.17.2.299.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

69.

Rohde C, Zhang YY, Reinhardt R, Jeltsch A: BISMA — Быстрый и точный анализ данных бисульфитного секвенирования отдельных клонов из уникальных и повторяющихся последовательностей.