Лампа ближнего света лада гранта: Какие лампы стоят в фарах Lada Granta (старое и новое семейство) » Лада.Онлайн — Шины для спецтехники, шины для погрузчика

Содержание

Какая лампочка на ближний свет лада гранта

Замена ламп ближнего света на Ладе Гранда

По статистике, лампы ближнего света выходят из строя чаще всего. Это происходит из-за более высокой нагрузки, длительности использования и других факторов. Состояние фар головного света — предмет постоянной заботы водителей, поскольку от них зависит безопасность всех участников движения. Рассмотрим, что представляет собой лампа ближнего света Гранта, как выбрать и заменить перегоревший экземпляр.

Как правильно выбирать лампы

Прежде всего, следует разобраться, какие лампочки устанавливаются в фарах головного света автомобиля Лада Гранта. Ближний и дальний свет обеспечивает одна и та же двухнитевая галогеновая лампа h5. В фаре новой Гранты Лифтбек стоят светильники, маркированные h29. Принципиальной разницы между ними нет, h29 — это современная модификация цоколя h5. Она представляет собой ту же галогеновую двухнитевую конструкцию.

Когда приходит время менять перегоревшую лампочку, основной задачей становится правильный выбор замены. Важно знать, что любое изменение конструкции является нарушением, что дает сотрудникам ГИБДД повод оштрафовать или даже лишить водителя прав на полгода или на год. Если вместо штатной галогеновой конструкции будут поставлены ксеноновые или светодиодные лампы, это будет расцениваться как внесение необоснованных изменений в конструкцию, способное повлечь за собой аварийные ситуации на дороге. Это вполне оправдано, поскольку блок-фары рассчитаны на установку определенного вида ламп, обладающих заданными параметрами и конфигурацией вольфрамовых нитей. Излишняя яркость или неправильная настойка светового пучка приводят к ослеплению водителей встречных машин, что недопустимо и опасно.

Важно! Необходимо также запомнить, что менять всегда придется обе лампы, даже если одна из них работает. Это обусловлено разницей в параметрах и конфигурации светового потока, имеющейся у всех светильников.

Подходящие виды ламп

Рассмотрим наиболее популярные и эффективные виды ламп в ближний/дальний свет Лады Гранты:

Philips h5 3700k x;
Osram Original Line;
Bosch Pure Light;
Mtf-Light Aurum h5;
Narva h5 Contrast+ и т. д.

Каждая из этих ламп обладает собственными достоинствами и особенностями. Например, две последних модели списка имеют одинаковую эффективность в любую погоду. Выбирая наиболее подходящий вариант, необходимо не просто искать самую яркую модель. Надо учитывать условия, в которых она будет эксплуатироваться. Если цветовая температура слишком завышена, оттенок свечения будет голубовато-белым. Это дает хорошую читаемость деталей, увеличивает дальность освещения, но в условиях непогоды все достоинства резко превращаются в сплошные недостатки — пучок света заставляет светиться снежинки, капли дождя или тумана, образуя светящийся кокон и затрудняя видимость для водителя. Оптимальный вариант для непогоды — мягкий желтый свет, который не изменяет восприятие и не создает помех для обзора.

Когда менять лампы

Большинство неопытных водителей считает, что смена ламп ближнего/дальнего света на Гранте должна производиться по мере выхода старых светильников из строя. Перегорели — меняем. Однако, такой подход может оказаться причиной немалых проблем. Если одна фара вдруг «ослепла» во время движения по междугородней трассе, а лампочки на замену с собой нет, неизбежны неприятные разговоры с сотрудниками ГИБДД. Поэтому правильнее отслеживать состояние светильников и менять их при окончании заявленного срока службы. Кроме того, это позволит выполнить процедуру замены в удобное время и в подходящих условиях, что не менее важно.

Необходимо помнить, что причиной прекращения работы ближнего света не всегда бывает выход из строя светильника. В первую очередь следует произвести проверку блока предохранителей, вполне возможно, что причина проблемы кроется в нем. Также возможно перегорание одной нити, когда дальний свет работает, а нить ближнего вышла из строя. В таких ситуациях также необходимо поменять светильник.

Процесс замены ламп в гранте

Рассмотрим, как происходит процесс замены ламп ближнего света в Ладе Гранте:

Подготовка

Замена производится под капотом, в условиях тесноты и ограниченного пространства. Для удобства выполнения работы можно временно отсоединить некоторые детали. Например, с левой (водительской) стороны будет удобно снять воздушный фильтр со всеми креплениями, проводами и датчиком. С правой стороны следует отсоединить защитную крышку двигателя.

Галогеновые лампы нельзя трогать руками — останутся следы, которые станут темными пятнами, ухудшающими качество света. На всякий случай следует приготовить салфетку и спирт, чтобы протереть колбу перед установкой для удаления возможных жирных пятен.

Пошаговая инструкция по замене лампочки в фаре ближнего света

Замена ламп ближнего света на Ладе Гранте Особой сложности не составляет. Порядок действий следующий:

нажатием на фиксатор отсоединить заднюю крышку фары;
аккуратно снять колодку с проводами, для чего может потребоваться некоторое усилие;
откроется резиновый чехол отсека ламп, который надо удалить, взявшись за специальный язычок и потянув за него;
нажатием на пружинный фиксатор вывести его усики из зацепления с крючками и отвести в сторону;
вынуть проблемную лампу и аккуратно вставить новую;
произвести сборку блока в обратном порядке.

Важно! После проверки работоспособности надо установить на место все временно отсоединенные детали. При наличии некоторого навыка все действия производятся буквально за пару минут.

Основные выводы

Для замены ламп ближнего света на Ладе Гранте не требуется особых навыков или познаний. Сама процедура достаточно проста и может быть выполнена даже неподготовленным человеком. Сложнее выбрать оптимальную модель светильника с подходящими характеристиками. Не следует ставить ксеноновые или светодиодные устройства, которые могут оказаться причиной ДТП или стать поводом для лишения прав. Необходимо использовать штатные конструкции, предусмотренные изготовителем.

0 0 голос

Рейтинг статьи

Замена лампы головного света гранта

Передняя оптика, генерирующая ближний свет, позволяет автомобилю Лада Гранта обеспечить в темное время достаточное освещение дорожного участка. В отличие от дальнего света данный режим характеризуется умеренной яркостью и «щадящим» направлением пучка без риска ослепления встречных водителей.

Если лампа ближнего света на авто Лада Гранта, отвечающая за ближний свет, является качественным изделием, то вибрация исходящего от нее светового пучка (видна водителю) категорически исключена. В обратном случае работа такого компонента будет затруднительным процессом в плане качественного освещения дорожного полотна. Многих водителей интересует то, как поменять лампочку ближнего света.

Как правильно выбирать лампы?

Отправившись за новыми лампочками, водителю Лада Гранта следует ознакомиться с маркировкой, нанесенной на поверхности штатного изделия. Так потребуется отыскать деталь с отметкой «h5». Мощность данного светового устройства ограничена на отметке в 55 Вт, что также является весомым критерием при подборе детали. Световые приборы, предназначенные генерировать дальний свет, наделены повышенной до 60 Вт мощностью.

Также не следует сбрасывать со счетов и производителя (марку), которым предлагаются рассматриваемые нами изделия. Во время покупки нелишней будет проверка работоспособности избранной покупателем лампы. Дополнительной помощью станет квалифицированная консультация работника торгового субъекта.

Внимательно осматривайте изделие на предмет отсутствия слабых контактов или некачественной спайки. Данные дефекты недопустимы, поскольку способны во время движения по неровностям вызвать исчезновение светового пучка, что опасно.

Когда менять лампы?

Если обнаружился факт перегорания рабочего элемента в лампе, то к замене светового устройства следует приступать без промедления. Специалистами рекомендуется осуществлять замену ламп сразу в двух фарах. Изначально заводом устанавливаются лампы с одинаковыми кондициями, что наделяет их примерно равным по продолжительности ресурсом. К монтажу ламп следует отнестись с особой ответственностью, что позволит исключить риск внезапной пропажи «света» во время движения.

Также владельцу следует приобретать изделия для левой и правой сторон авто с идентичной маркировкой (стандартной) и только изготовленные одним производителем. Ведь разные лампы обладают собственными качественными кондициями, особенностями реализации светового пучка, сроком службы и прочими параметрами. Избежать неоправданных проблем и их последствий возможно только за счет приобретения комплекта устройств.

Процесс замены ламп в Гранте

Замена лампочки ближнего света в машине LADA Granta выглядит весьма просто. Во избежание повреждения устройств их замену рекомендуется выполнять в специально подготовленном гараже. Это позволит водителю удобно расположить все сопутствующие процессу компоненты.

Соблюдая требование безопасности, отключаем АКБ путем съема клемм.
С тыльной стороны блок-фары снимаем крышку корпуса путем вращения против движения часовой стрелки.
Отсоединяем от выводов лампы питающие провода.
Демонтируем резиновое уплотнение, призванное удерживать осветительный прибор.
Удаляем отработавшую лампу и монтируем новое изделие на автомобиле LADA Granta.

Замена лампочки ближнего света не позволит занять у владельца более 15 минут времени. Учитывая простоту манипуляций, данная замена под силу даже малоопытному автомобилисту. Завершив работу, рекомендуется проверить функционирование новых ламп. Если какая-либо из ламп отказывается воспроизводить свет, то прибегаем к повторной проверке правильности коммутации проводов с осветительным прибором.

Заметим, что присутствие ламп в фарах Лада Гранта является обязательным условием, регламентированным законодательным способом, и не зависит от того, использует ли владелец свой автомобиль в темное время.

Также не рекомендуется экономить, лампа ближнего света не должна быть дешевой, поскольку в этом не только отсутствует всяческий смысл, но и стоимость их превращает эту затею в бессмысленное мероприятие. Теперь вы знаете, как поменять лампочку ближнего света, и в этом нет ничего сверхсложного.

В блок-фаре Лада Гранта установлены лампы h5 ближнего/дальнего света мощностью 55/60 Вт. На новом семействе применяются лампы h29. В ходе эксплуатации они могут перегореть. В статье представлена инструкция, как поменять лампочку ближнего света, а также особенности этого процесса, которые не указаны в руководстве по эксплуатации автомобиля.

Лампа головного света – галогенная. Касаться ее стеклянной колбы пальцами нельзя, т.к. на ней останутся следы, которые ухудшать освещение фары. Очистить лампу можно чистой ветошью, смоченной в спирте.

Для более удобного доступа к левой фаре (по ходу движения автомобиля) рекомендуется сдвинуть корпус воздушного фильтра двигателя в сторону, освобождая все его крепления, жгут проводов и датчик.

Получить больше пространства для доступа к правой фаре следует снять крышку двигателя, вывернув крышку маслозаливной горловины, а затем отщелкнуть крышку, потянув ее вверх. Не забудьте обратно завернуть крышку, чтобы в горловину не попали посторонние предметы!

Порядок действий:

Снять крышку с фары, нажимая на фиксатор.
Снять колодку с проводами, потянув за нее с достаточным усилием.

Снять резиновый чехол, потянув его за язычок.

Отщелкнуть и отвести в сторону фиксатор лампы, выводя концы фиксатора из зацепления.
Снять лампу ближнего/заднего света.

Установка лампы производится в обратной последовательности. Весь процесс замены также показан на видео:

Напомним, если вы желаете сделать тюнинг фар, рассмотрите вариант установки ресничек.

Любая машина в процессе эксплуатации нуждается в уходе и обслуживании. Довольно часто необходим ей мелкий ремонт или замена какого-либо вышедшего из строя узла. По большей мере незначительные неисправности водитель должен уметь устранять самостоятельно – такой подход позволяет сэкономить немало денег.

В настоящей статье мы расскажем, как на Ладу Гранта (лифтбек или седан) производится замена пришедшей в негодность лампы ближнего света, а также поведаем о путях устранения некоторых часто встречаемых неполадок с внешним освещением. Стоит указать еще, что все эти работы способен без труда выполнить даже очень неопытный автовладелец.

Советы по обслуживанию

Как известно, даже самая незначительная поломка, не устраненная вовремя, способна в результате привести к серьезным проблемам. Потому необходимо выполнять следующие простые рекомендации, позволяющие продлить срок эксплуатации вашей машины на годы:

совершайте регулярный осмотр как можно чаще;
контролируйте состояние установленных на ней приборов;
используйте исключительно качественные комплектующие;
поломки устраняйте максимально аккуратно.

Касательно фар – их работоспособность нужно проверять перед каждым выездом на дорогу. Причем ежемесячно необходимо следить за тем, в каком состоянии пребывает электропроводка.

Она должна всегда быть надежно зафиксирована в держателях, а не болтаться.

На проблему со светом указывают:

нехарактерное потрескивание при зажигании фар;
громкие щелчки реле;
несрабатывание кнопки;
отказ переключателя подрулевого.

Здесь нужно как можно скорее разобраться с неисправностью, пока внешнее освещение не вышло из строя полностью. Если остекление фар было повреждено – его необходимо заменить. В противном случае внутрь быстро просочиться влага и контакты окислятся.

Приобретая новые лампы, важно помнить несколько простых истин:

слишком мощные светят немного ярче, но увеличивают нагрузку на электроцепи;
дешевые быстро перегорают – частая замена приводит к росту расходов.

Занимаясь починкой самостоятельно, важно всегда следить за тем, чтобы не испортить соединительные клеммы или сами провода. При разрыве одного из них стоит заменить его полностью – изолента или скрутка никогда не станут достойной альтернативой.

Если таких слабых мест накопится достаточно много – то в итоге:

вырастет сопротивление проводки и соответственно нагрузка;
могут возникнуть короткие замыкания и часто – пожар;
постоянно будут гореть предохранители.

Как поменять

Прежде всего, стоит напомнить неопытным автолюбителям, что на Гранте нет отдельной лампочки ближнего света. В фаре установлена только одна универсальная, внутри которой расположены две нити накаливания:

первая отвечает за дальний свет и имеет мощность в 60 Ватт;
вторая за ближний (55 Вт).

Тип патрона у нее Н4. Какая лампа лучше всего? Отзывы свидетельствуют, что сейчас наиболее качественные производит компания «Филипс» на своем московском заводе.

Сама по себе процедура замены лампочки весьма проста. Порядок выполнения работ следующий:

обесточиваем электрическую систему путем отключения провода с минусовой клеммы АКБ;

на заглушке фары отыскиваем фиксатор (он расположен вверху) и, надавив на него, открываем себе доступ внутрь;
там есть разъем с проводами питания – отсоединяем и сдвигаем его в сторону;
убираем заглушку из резины, препятствующую попаданию в середину грязи и жидкости;
нажав на усики пружинки фиксатора, освобождаем лампу и извлекаем ее.

Перед тем как выбросить отслуживший элемент – убедитесь, что нить накаливания действительно повреждена. Вполне может так случиться, что в реальности свет не включается по другой причине.

Вставляя новую, необходимо избегать прикосновений пальцами к колбе. Налет грязи и жира на ней приводит к очень быстрому перегоранию лампы. Лучше вообще перед монтажом протереть стеклянную часть спиртом или ацетоном (одеколон здесь не подойдет). Правильнее всего выполнять такие работы в хлопчатых тонких перчатках.

Сборка фары производится в обратном порядке.

Почему не включается свет

Довольно часто виноваты в подобном отказе отнюдь не лампочки, а другие причины. Их в целом несколько:

окисление контактов реле;
поломка переключателя, находящегося под рулем;
короткое замыкание и выход из строя предохранителя.

Реле располагается в монтажном блоке и промаркировано следующим образом – К4. Иногда его приводит в чувство легкое постукивание. Однако проще будет просто заменить данный элемент на новый – цена реле невысока.

Проверить – работает ли подрулевой рычаг сравнительно несложно при включенных фарах:

с колонки снимают корпус;
отсоединяют колодку с проводами, идущими к переключателю;
проблема не в нем, если после этого свет продолжает гореть, в противном случае рычаг меняют.

Закоротить проводку может:

из-за слишком мощных ламп;
перетирания изоляции;
замокания колодок.

В это ситуации в первую очередь смотрят на предохранители – перегоревший свидетельствует о замыкании. Чаще всего оно происходит непосредственно в фаре – там слипаются контакты как дальнего, так и ближнего света – поломка устраняется путем их разъединения.

С процедурой замены можно познакомиться лучше, просмотрев данное видео:

Предохранители и реле в Лада Гранта, электрические схемы

Если вы купили Гранту и у вас начались проблемы с электрикой, возможно вы столкнулись с заводским браком. Но не пугайтесь раньше времени, первым делом нужно проверить предохранители и реле в Лада Гранта и выяснить причину неисправности. Если вам повезёт, то отделаетесь простой заменой предохранителя.

Если нет, то возможно придётся ехать в автосервис или же устранять неполадки электроники самому. Запомните — главное в таких случаях полностью разобраться в проблеме, не жалейте на это времени, ведь любой автовладелец должен знать как можно больше про свой автомобиль (тем более отечественный).

Блок предохранителей

Блок предохранителей в Гранте находится слева от рулевой колонки, около ручек включения света. Чтобы снять крышку и добраться до предохранителей и реле, потяните верхнюю левую часть крышки на себя. Сделано удобно, всё находится под рукой и не надо никуда лезть, вставая с водительского сиденья. Может быть это намёк на то, что их часто придётся менять, а может просто удобство — разработчикам виднее.

F1 (15 А) — блок управления двигателем, форсунки, катушка зажигания, реле вентилятора охлаждения, КЗ 2х2.

Если у вас проблемы с электроникой, и замена этого предохранителя не помогает, в худшем случае придётся перепрошивать ЭБУ или менять его. Также при перегорании этого предохранителя перестают работать форсунки и катушка зажигания, что делает работу двигателя невозможной. Поэтому если Гранта не заводится, проверьте первым делом данный предохранитель.

F2 (30 А) — электростеклоподъемники.

Если не работают и замена предохранителя не помогает, попробуйте выдернуть его совсем или снять клемму с аккумулятора на пару минут, затем подключите снова. Таким способом должны сброситься все временные ошибки и если дело в них, стеклоподъёмники снова заработают.

F3 (15 А) — аварийная сигнализация. Если не работает, проверьте этот предохранитель, а также кнопку включения «аварийки», её контакты и работоспособность ламп.

F4 (20 А) — стеклоочиститель, подушка безопасности.
Если на приборной панели загорелась контрольная лампа отсутствия подушки безопасности, проверьте этот предохранитель. Дело может быть либо в нём, либо в электронном блоке, либо в самих подушках.

Если не работает стеклоочиститель и данный предохранитель целый, проверьте также реле K6, ручку включения, надёжность подключения к ней разъёмов, а также сам электропривод стеклоочистителя.

F5 (7,5 А) — клемма 15 замка зажигания. Если проблемы с включением зажигания, проверьте этот предохранитель, а также надёжность соединений проводов к клеммам замка.

F6 (7,5 А) — лампа заднего хода. Если она не работает, но этот предохранитель целый, проверьте саму лампу, а также контакты подключения разъёмов к блок-фаре.

F7 (7,5 А) — ДМРВ, клапан адсорбера, датчик кислорода, датчик скорости.
Если двигатель работает неустойчиво, не держит холостые обороты или самопроизвольно глохнет, дело может быть в этом предохранителе либо соответствующем датчике. О том, как проверить ДМРВ у нас уже была статья.

F8 (30 А) — обогрев заднего стекла. Если он не работает, проверьте этот предохранитель, клеммы подключения проводов к обогревателю, а также целлостность его элементов.

F9 (5 А) — правые габаритные лампы

F10 (5 А) — левые габаритные лампы. Если не горят габариты, дело может быть в этих предохранителях или в самих лампах, а также их разъёмах. Не помешает проверить переключатель габаритов на приборной панели.

F11 (5 А) — задние противотуманные фары. Если они не работают, но данный предохранитель целый, дело может быть в переключателе на приборной панели или в самих лампах, а также их разъёмах

F12 (7,5 А) — правая лампа ближнего света
F13 (7,5 А) — левая лампа ближнего света. Если не работает ближний свет в двух фарах одновременно, дело может быть в реле K9, либо в ручке включения ближнего света и её контактах. Если не горит только одна лампа, скорее всего дело в этом предохранителе или в самой лампе, которую нужно заменить.

F14 (10 А) — правая лампа дальнего света
F15 (10 А) — левая лампа дальнего света. Если не работают обе фары дальнего света, дело может быть в реле K7. Если только одна — заменить предохранитель и/или лампу.

F16 (10 А) — Передняя правая противотуманная фара

F17 (10 А) — Передняя левая противотуманная фара. Если они не работают, проверьте переключатель на приборной панели, а также его контакты. Если не работает одна противотуманная фара, скорее всего сгорела лампа и нужно её заменить.

F18 (15 А) — обогрев передних сидений. Если он не работает, но данный предохранитель целый, проверьте кнопку включения обогрева на приборной панели.

F19 (10 А) — ABS. Если при нажатии на педаль тормоза на скользкой дороге колёса блокируются и педаль не «отпружинивает» назад, значит ABS не работает и дело может быть в этом предохранителе или в механических элементах системы торможения.

F20 (15 А) — диагностический разъём, звуковой сигнал, замок багажника, КПП, прикуриватель. Очень частое перегорание данного предохранителя обычно вызывается замыканием или неправильным подключением приборов в разъём прикуривателя. Если не открывается багажник, это может быть связано с прикуривателем. Заменив данный предохранитель, проблема должа решиться.

F21 (15 А) — электрический бензонасос. Если автомобиль неожиданно заглох посередине дороги и бензина в баке очень мало, может быть сгорел этот предохранитель. Без нагрузки (без бензина) работа бензонасоса может привести к его выходу из строя. Поэтому заправьтесь и проверьте данный предохранитель.

F22 (15 А) — центральный замок.

Если например работает только центральный замок водительской двери, а остальные не запираются, дело может быть в этом предохранителе, а также в блоке управления. Лучше доверить диагностику и ремонт специалистам, если нет опыта.

F23 (10 А) — лампы дневных ходовых огней. Если не работают огни с обоих сторон, скорее всего дело в этом предохранителе или в переключателе на приборной панели. Если не работает лампа только с одной стороны, скорее всего дело в самой лампе.

F24 (7,5 А) — кондиционер. Если он не работает и этот предохранитель целый, возможно дело в ручке включения на приборной панели. Диагностику системы кондиционера лучше доверить специалистам. Может быть требуется его заправка или обслуживание.

F25 (10 А) — освещение салона, лампы стоп-сигналов. Если не работают стоп-сигналы и данный предохранитель целый, дело может быть в самих лампах и их разъёмах или в выключателе стоп-сигналов в педальном приводе.

F26 (25 А) — ABS. Аналогично F19

F27 — резерв

F28 — резерв
F29 — резерв
F30 — резерв

F31 (50 А) — обогрев лобового стекла

F32 (30 А) — печка, электроусилитель руля. Если при повороте руля наблюдается неравномерная работа усилителя или руль поворачивается с трудом, проверьте данный предохранитель. Также дело может быть в электронном блоке управления или недостаточном уровне тормозной жидкости в бачке электроусилителя.

Блок реле Лада Гранта

Реле находятся в том же блоке предохранителей и реле, который расположен слева от рулевой колонки под крышкой.

K1 — реле вентилятора печки

K2 — реле электростеклоподъемников. Если они не работают, проверьте также предохранитель F2, если не поможет, то дело может быть в блоке управления.

K3 — реле стартера. Если он не работает (не крутит) и данное реле рабочее, проверьте уровень заряда аккумулятора. Также дело может быть во втягивающем или в замке зажигания и его контактах.

K4 — реле клеммы 15 замка зажигания

K5 — реле поворотников и аварийной сигнализации. Если поворотники горят и не выключаются, возможно замкнуло это реле. Проверьте также предохранитель F3 (режим «аварийки»).

K6 — реле стеклоочистителя. Проверьте также предохранитель F4.

K7 — реле дальнего света. Проверьте также предохранители F14 и F15 и сами лампы.

K8 — реле звукового сигнала. Проверьте также предохранитель F20, контакты выключателя сигнала на руле.

K9 — реле ближнего света. Проверьте также предохранители F12 и F13 и сами лампы.

K10 — реле обогрева заднего стекла. Если не работает обогрев, дело может быть и в предохранителе F8.

K11 — реле блока управления двигателем. Проверьте также предохранитель F1.

K12 — реле электрического бензонасоса. Проверьте также предохранитель F21.

Силовые предохранители

Блок силовых предохранителей находится под капотом и расположен между аккумулятором, опорой стойки и бачком охлаждающей жидкости. Выглядит в виде вертикально установленной коробки. Сняв с неё верхнюю крышку, появляется доступ к силовым предохранителям.

F1 (50 A) — электроусилитель руля. Если руль крутится туго, проверьте также предохранитель F32.

F2 (30 A) — вентилятор отопителя

F3 (60 A) — генератор. Если происходит быстрый разряд аккумулятора или горит лампа разряда, проверьте данный предохранитель, а также работу самого генератора и его щётки.

F4 (60 A) — генератор

F5 (30 A) — ближний свет фар. Проверьте также реле K9 и предохранители F12, F13.

При устранении любых неполадок, связанных с электрикой, будьте осторожны. Замену предохранителей и реле выполняйте только на заглушённом двигателе с выключенным зажиганием.

Если в вашем автопарке имеются не только Гранты, можете прочитать также про предохранители и реле Калины.

Лампа ближнего света Лада Гранта: замена

Осветить дорогу автомобилисту в темное время суток позволяют лампы ближнего света. Они в отличие от дальних габаритов имеют незначительную яркость и обеспечивают хороший обзор полотна непосредственно перед транспортом.

Качественная лампа ближнего света Лада Гранта не должна реагировать на вибрации по время передвижения авто. В противном случае ее работа будет весьма затруднена.

Как выбрать хорошие лампы ближнего света на Гранту?

Прежде всего, водитель должен ориентироваться на маркировку штатный изделий. Необходимо в автомагазине или салоне найти модель с пометкой h5. Ее мощность составляет 55 Вт, на что также стоит обратить особое внимание. Поскольку лампы для дальнего света с такой же маркировкой имеют большую мощность – 60 Вт.

Нужно учитывать и производителя, предлагающего автомобильные дополнения. Рекомендуется при покупке проверить, насколько лампа ближнего света Гранта хорошо светит. Также поможет консультация специалистов, которые укажут на особенности работы изделия.

Недопустимо, чтобы на лампе была некачественная спайка или слабые контакты. Иначе это приведет к пропаданию освещения при езде по неровным проселочным дорогам.

Когда нужно проводить замену ламп ближнего света на Гранте?

Приступать к работе нужно не только при перегорании лампы, но и после определения ее недостаточного свечения. Специалисты рекомендуют проводить замену сразу двух элементов.

На заводе автомобиль оснащается одинаковыми по состоянию лампами, поэтому их срок эксплуатации приблизительно одинаковый. Чтобы в отдалении от города водитель не столкнулся с проблемой пропажи ближнего света, нужно выполнять установку новых компонентов одновременно.

Естественно для Лада Гранта лампа ближнего света для левой и правой стороны должна не только соответствовать стандартной маркировке, но и быть произведена у одной компании. Отличия разных изготовителей и в качественности изделий, и в сроке их службы.

Избежать последующих проблем можно лишь при покупке пары от одного завода. Можно приобретать как изделия отечественного, так и заграничного производства.

Процедура замены лампы на Ладе Гранте

Выполняется операция по установке довольно просто. Но чтобы не повредить лампу или крепления рекомендуется проводить замену в оборудованном гараже. Там водитель сможет удобно разместить все требуемые компоненты. Предварительно нужно отсоединить клеммы от аккумулятора. Инструменты для работы не нужны, проводится замена по следующей простой схеме:

1. Против часовой стрелки снимается крышка с ламп дальнего и ближнего света.

2. От лампы ближнего света отсоединяются провода питания.

3. Снимается резиновый уплотнитель, придерживающий осветительный элемент.

4. Удаляется старая лампа и устанавливается новая.

Приблизительно занимает замена лампы ближнего света Грант около 10 минут. Учитывая простоту выполнения, данную задачу сможет решить любой автомобилист. После завершения установки следует проверить работу элементов. Если одна из них не работает, нужно перепроверить подведение проводов. При необходимости провести повторное подключение.

Выполнять установку новой лампы нужно в обязательном порядке, даже если водитель не использует авто в вечернее или ночное время. Поскольку неработающая лампа представляет опасность при езде в условиях даже небольших осадков или тумана. Стоимость элементов незначительна и не требует особых затрат. Поэтому экономия в данном случае не имеет смысла.

Вам также может быть интересно

Автор всех статей на сайте!
Собственный сервис “Нью-Лайн Авто”
Все виды работ.
Специализация: Lada

Лампы Лада Гранта. Как поменять любую лампочку.

Исправная оптика в автомобиле, это ваша безопасность и здоровье, жизнь пешеходов и обоснованные требования ПДД. Следите за тем, чтобы все лампочки работали исправно. Это поможет избежать штрафов, сберечь здоровье и нервы.

В таблице указаны лампы, которые установлены в Лада Гранта. Среди множества производителей мы рекомендуем выбирать лампы Bosh, Narva или Osram.

Как поменять лампы

Система освещения Лада Гранта простая и практичная. Чтобы поменять лампы в фарах, вам не нужны специальные инструменты. Достаточно прочитать нашу инструкцию и выполнить рекомендации.

Передняя оптика

В Лада Гранта установлены лампы ближнего и дальнего света h5. Чтобы поменять лампу вам понадобятся перчатки, длинная прямая отвертка и фонарик.

При замене лампы, не берите её за баллон. Во время работы она сильно нагревается и охлаждается через стекло. Если на баллоне будут частицы жира с пальцев, то теплообмен лампы будет нарушен. Она быстро перегорит.

Сначала снимаем крышку, которая закрывает фару. Она находится за фарой под капотом. Чтобы её снять, надо надавить пальцем на пластиковую собачку, которая расположена сверху, и отверткой отжать крышку с двух направляющих.

После того, как вы сняли крышку, отсоединяем разъемную колодку. Достаточно просто потянуть её от фары. Дальше снимаем уплотнительное резиновое кольцо.

Лампа закреплена фиксирующими скобами. Надо нажать на них по направлению к фаре, вывести из зажимов и отвести в сторону. Лампу можно вынимать.

Собираем в обратном порядке: устанавливаем лампочку, защелкиваем фиксаторы, ставим уплотнительное кольцо, присоединяем разъемную колодку и закрываем крышку.

При установке новой лампы, надо совместить направляющие лучи на цоколе лампы с пазами в месте крепления. В другом положении лампу установить невозможно.

При сборке проверьте, чтобы фиксирующие скобы прочно закрепили лампу и обе вошли в пазы. Тщательно устанавливайте уплотнительное кольцо. Важно, чтобы пыль не попадала в фару, иначе придется её менять через какое-то время. Будьте осторожны при снятии и установки крышки. Пластиковая собачка может сломаться, если на неё слишком сильно надавить.

ВАЖНО: Меняйте лампы в перчатках. Если на баллоне останутся частичек жира с пальцев, то это сильно сократит срок их работы.

ВАЖНО: Поменять указатели поворота ещё проще. Надо найти патрон, повернуть его против часовой стрелки и достать лампочку. Новую лампочку надо вставить в пазы патрона, немного нажать и повернуть по часовой стрелки. Остается установить патрон с лампочкой на штатное место.

Лампу в противотуманной фаре заменить немного сложнее. Чтобы получить к ней доступ, надо вывернуть руль и отвернуть два самореза, которые соединяют бампер и подкрылок. После этого отщелкнуть бампер с креплений.

Отгибаете бампер сантиметров на 15-20, чтобы можно было достать до фары, и выкручиваете лампу против часовой стрелки на четверть оборота. Устанавливаете всё в обратном порядке.

Задняя оптика

С задними фонарями всё элементарно. Доступ к ним из багажника. Справа и слева расположены пластиковые вставки с отверстиями. Чтобы получить доступ ко всем лампочкам, надо снять эти вставки. В отверстие просовываете палец, нажимаем на пластиковую защелку и снимаем вставку. Так вы получаете доступ ко всем лампочкам, которые расположены в задних фонарях. Остается только вынуть нужную лампу и заменить её на новую. После замены ставите на место пластиковую вставку.

Замена любой лампы на Лада Гранта займет не больше 10 минут. Немного больше времени потребуется только на замену лампочек в противотуманных фарах.

Lada Granta. Установка светодиодных дневных ходовых огней на Лада Гранта

АвтоВАЗ любит придумывать самые лучшие схемы и нестандартные решения. Вот в этот раз тоже самое.
Распиновка на стандартном цоколе — совершенно нестандартная. Поэтому если установить обыкновенную светодиодную led лампу, то возможны следующие варианты: либо не будет работать ходовой огонь (или габариты), либо начнет дымиться..

Вариантов решения этой задачи несколько.

Вариант 1.
Переделать разъем в автомобиле. Для этого необходимо разобрать разъем, распилить контакт, каким то образом закрепить контакты в цоколе и перепаять контакты. По моему бесперспективно, как все это будет держаться и как скоро все развалиться.

Вариант 2.
Переделать светодиодную лампочку. Разобрать цоколь и перевернуть, перепаять контакты. Вроде не сложно, при условии, что лампочку удастся разобрать и не сломать при обратной сборке.

Вариант 3.

Самый варварский. Высверлить полностью цоколь из штатного разъема Гранты. Вклеить туда лампочку намертво и провода уже или припаять так как нужно, или купить дополнительный разъем и на него припаять.

Самый правильный Вариант — использование специальных Неполярных светодиодных Led ламп. Это означает, что каким бы образом не подавали «+» и «-«, электроника внутри лампы сама определит, каким образом подавать питание на чипы.

Вот например эта лампа.

Оцените!
Световой поток — 720 Lm (галогеновая лампа ближнего света дает поток 1200 Lm)
Чипы — американского производства CREE, 6 шт
Мульти напряжение от 12 до 24 В
Неполярные
Заявленный срок службы более 30000 часов.

На фото указан предохранитель дневных ходовых огней на автомобиле Лада Гранта.
При экспериментах и подборе светодиодных ламп — он часто сгорает.

Для сравнения.
В одной фаре автомобиля Лада Гранта установлена светодиодный ДХО, в другой — стандартная лампа.

А теперь как смотрится в темноте. Разница очевидна!

Светодиодный ходовой огонь и включенный ближний свет.
Ну в общем, ближний — дальний свет тоже нужно менять на светодиодные лампы.
Например, на такие — LED CARS h5 HI/LO 3600 LM

Несколько фотографий для обзора.

Если вы ищите где купить светодиодные ходовые огни на Ладу Гранта, то оформляйте заказ с бесплатной доставкой по Республике Башкортостан на нашем сайте www.Sabbas.ru
Если вы ищите где установить светодиодные ходовые огни , то приезжайте к нам в Установочную студию «SabbaS» по адресу: г. Уфа, ул. Коммунистическая, 116

FRET микроскопия для мониторинга сигнальных событий в живых клетках в реальном времени с использованием мономолекулярных биосенсоров

J Vis Exp. 2012; (66): 4081.

Джулия У. Шпренгер

Группа Эмми Нётер из DFG, Отделение кардиологии и пневмологии, Европейский институт кардиологических исследований, Геттинген, Медицинский центр Университета Георга Августа, Геттинген, Германия

Руван К.

Перера

Группа Эмми Нётер в DFG, Отделение кардиологии и пульмонологии, Европейский институт кардиологических исследований, Гёттинген, Медицинский центр Университета Георга Августа, Гёттинген, Германия

Конрад Р.Götz

Группа Эмми Нётер в DFG, Отделение кардиологии и пневмологии, Европейский институт кардиологических исследований, Гёттинген, Медицинский центр Университета Георга Августа, Геттинген, Германия

Вячеслав О. Николаев

Группа Эмми Нётер из DFG, Отделение кардиологии и Пневмология, Европейский институт кардиологических исследований в Геттингене, Медицинский центр Университета Георга Августа, Геттинген, Германия

Группа Эмми Нётер из DFG, Отделение кардиологии и пневмологии, Европейский институт кардиологических исследований в Геттингене, Медицинский центр Университета Георга Августа, Геттинген, Германия

Abstract

Микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) Фёрстера продолжает приобретать все больший интерес как метод мониторинга биохимических и сигнальных событий в живых клетках и тканях в реальном времени. По сравнению с классическими биохимическими методами эта новая технология отличается высоким временным и пространственным разрешением. В экспериментах FRET используются различные генетически закодированные биосенсоры, которые можно экспрессировать и отображать с течением времени in situ или in vivo ^1-2.Типичные биосенсоры могут либо сообщать о межбелковых взаимодействиях, измеряя FRET между парой белков, меченных флуорофором, либо конформационные изменения в одном белке, который содержит донорные и акцепторные флуорофоры, связанные со связывающим фрагментом для интересующей молекулы ^3-4. Бимолекулярные биосенсоры для белок-белковых взаимодействий включают, например, конструкции, предназначенные для мониторинга активации G-белка в клетках ⁵, в то время как мономолекулярные сенсоры, измеряющие конформационные изменения, широко используются для визуализации вторичных мессенджеров, таких как кальций ⁶, цАМФ ^{7 -8}, инозитолфосфаты ⁹ и цГМФ ^10-11. Здесь мы описываем, как создать индивидуальную эпифлуоресцентную систему визуализации FRET из отдельных коммерчески доступных компонентов и как управлять всей установкой с помощью бесплатного программного обеспечения Micro-Manager. Этот простой, но мощный прибор разработан для рутинных или более сложных измерений FRET в живых клетках. Полученные изображения обрабатываются с помощью самописных плагинов для визуализации изменений соотношения FRET в реальном времени во время любых экспериментов перед сохранением в графическом формате, совместимом со встроенным бесплатным программным обеспечением ImageJ, используемым для последующего анализа данных.Эта недорогая система отличается высокой гибкостью и может успешно использоваться для мониторинга различных биохимических явлений и сигнальных молекул с помощью множества доступных биосенсоров FRET в живых клетках и тканях. В качестве примера мы демонстрируем, как использовать эту систему визуализации для выполнения мониторинга цАМФ в живых клетках 293A в режиме реального времени при стимуляции агонистом и блокатором β-адренергических рецепторов.

Ключевые слова: Молекулярная биология, выпуск 66, медицина, клеточная биология, FRET, микроскоп, визуализация, программное обеспечение, цАМФ, биосенсор

Протокол

1.Настройка микроскопа для визуализации FRET

В принципе, любой имеющийся в лаборатории инвертированный флуоресцентный микроскоп с портом для камеры может быть адаптирован для получения изображений FRET. Окончательная установка должна включать в себя следующие важные компоненты: микроскоп, источник света с дополнительным затвором или без него, светоделитель для испускаемого света и CCD-камеру (см. Рисунок 1 ). Аппаратные устройства, особенно источник света, затвор и камера, интегрированы и управляются программным обеспечением для обработки изображений, которое позволяет получать и анализировать изображения.Ниже мы описываем процедуру сборки простой системы FRET из имеющихся в продаже компонентов.

Подключите источник света к микроскопу. Например, используйте светоизлучающий диод с одной длиной волны (CoolLED p E-100, 440 нм), который избирательно возбуждает усиленный голубой флуоресцентный белок (CFP), используемый в качестве донора в большинстве биосенсоров FRET. Его можно напрямую и легко подключить к порту эпифлуоресцентной подсветки микроскопа. Также доступны многоволновые светодиоды, которые можно подключать аналогичным образом.Вместо светодиода можно использовать другие стандартные источники света, такие как ксеноновая дуговая лампа XBO75 (часто используемая для микроскопов Olympus и Zeiss) или ртутная лампа HBO (обычно устанавливаемая на микроскопы Nikon). В случае люминесцентной лампы вы также должны разместить заслонку между лампой и портом освещения, чтобы обеспечить программное управление светом возбуждения, попадающим на образец. CoolLED не требует дополнительной шторки, так как ее можно напрямую включать и выключать с помощью программного обеспечения. Недостатком одноцветных светодиодных систем является ограниченное количество длин волн возбуждения, тогда как люминесцентная лампа с различными наборами фильтров является более гибким вариантом, особенно при работе с множественными и бимолекулярными биосенсорами. В качестве альтернативы можно использовать монохроматорные источники света (, например, Polychrome V, TILLPhotonics); они обычно имеют встроенный затвор, которым можно управлять программно с помощью сигнала запуска.
Поместите соответствующий фильтрующий куб в микроскоп. Для рутинных измерений FRET с CFP и усиленным желтым флуоресцентным белком (YFP) или любым из их вариантов в качестве пары FRET мы используем простой фильтрующий куб, содержащий фильтр возбуждения ET436 / 30M (который можно не использовать при использовании светодиода, но он необходим. при использовании ксеноновой или ртутной лампы вместо светодиодной) и дихроичного зеркала DCLP455.Микроскоп также должен быть оснащен объективом, подходящим для флуоресцентной микроскопии с хорошим разрешением, например, с иммерсионным масляным объективом план-флюор, план-неофлуар или план-апохромат 40x, 60x или 100x.
Включите люминесцентный свет и проверьте, равномерно ли распределено световое пятно в поле зрения. В противном случае требуется дополнительная юстировка светодиода или лампы для достижения оптимального освещения образца. Это можно сделать, используя винты, которые устанавливают диод или лампу в пространстве.
Подключите светоделитель через C-крепление к одному из портов излучения микроскопа. Например, используйте DV2 DualView (Photometrics), который разделяет излучаемый свет на два (донорный и акцепторный) канала, которые можно одновременно контролировать на одной микросхеме камеры CCD. В качестве альтернативы есть другие сопоставимые продукты, такие как Optosplit (Cairn Research) или светоделитель, интегрированный в двухволновую камеру Hamamatsu ORCA-D2. Для пары CFP / YFP FRET мы используем набор фильтров 05-EM, содержащий дихроичное зеркало 505dcxr плюс эмиссионные фильтры ET480 / 30M и ET535 / 40M для CFP и YFP, соответственно, которые поставляются с DV2.Вместо светоделителя два фильтрующих куба для донора (содержащие фильтр возбуждения ET436 / 30M для CFP, дихроичное зеркало DCLP455 и эмиссионный фильтр CFP) и акцептор (содержащий фильтр возбуждения CFP, DCLP455 и эмиссионный фильтр YFP) каналы используются во многих системах FRET. В качестве альтернативы можно установить один фильтрующий куб без какого-либо эмиссионного фильтра и положение колеса автоматического эмиссионного фильтра перед установкой камеры. В этом случае моторизованный микроскоп или колесо фильтров переключаются между двумя положениями эмиссионного фильтра в течение ~ 200-300 мсек для выполнения логометрического изображения.Эта небольшая задержка приемлема при визуализации довольно медленных внутриклеточных процессов, таких как сигналы цАМФ, когда действительно одновременное получение обоих каналов не критично.
Подключите камеру CCD (используйте, например, ORCA-03G или ORCA-R2 от Hamamatsu Photonics) к светоделителю. Используйте кабель FireWire для подключения камеры к компьютерному интерфейсу IEEE1394, как описано в руководстве, прилагаемом к камере. Установите драйверы камеры, не включая камеру.
Наконец, чтобы установить связь между компьютером и источником света, подключите плату ввода-вывода Arduino (например, Arduino Duemilanove или Arduino Uno) к светодиоду или шторке с помощью кабеля BNC, который должен содержать обычный штекер BNC на стороне светодиода и два одиночных провода на другом конце, подключенные к контактам GND (0) и 8 платы, как показано на Рис. 2 .Собранная плата может быть напрямую подключена к USB-порту вашего компьютера.

2. Настройка программного обеспечения для обработки изображений

Для управления и синхронизации источника света с захватом изображения камерой на компьютере должно быть установлено программное обеспечение для обработки изображений. Существует несколько коммерчески доступных программных пакетов, включая MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Visitron Systems). Здесь мы демонстрируем использование бесплатного программного обеспечения Micro-Manager с открытым исходным кодом, которое обеспечивает высокую степень гибкости для недорогой обработки изображений.

Загрузите это программное обеспечение с http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/index.php/Micro-Manager_Version_Archive. Мы рекомендуем установить версию 1.4.5, которую легко настроить в наших руках.
Подключите плату Arduino к USB-порту вашего компьютера. Загрузите программное обеспечение для управления платой Arduino с http://www.arduino.cc/en/Main/software. Следуйте инструкциям на этом веб-сайте и запустите это программное обеспечение только один раз перед запуском Micro-Manager.Загрузите код для использования платы с программным обеспечением Micro-Manager. Код можно скачать по адресу http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/index.php/Arduino.
Включите светодиод и камеру. Запустите программное обеспечение и настройте связь Micro-Manager с камерой и светодиодом (другим источником света и затвором), выбрав «Инструменты»> «Мастер настройки оборудования» (см. , рис. 3, ). Добавьте необходимые компоненты, включая камеру (, например Hamamatsu_ DCAM ) и плату Arduino (добавьте устройства Arduino-Switch , Arduino-Hub и Arduino-Shutter ).На следующих шагах используйте настройки по умолчанию, предложенные мастером. По запросу мастера сохраните новую конфигурацию системы.
Используйте главное меню, чтобы открыть Инструменты> Обозреватель свойств устройства. Прокрутите вниз до «Arduino Switch State» и выберите «1». Закройте диалог. Убедитесь, что в главном диалоговом окне программы установлен флажок «Автозатвор». Нажмите «Файл»> «Сохранить состояние системы», чтобы сохранить конфигурацию программного обеспечения, которую следует открыть в любое время после запуска программного обеспечения. Это установит связь между платой и программным обеспечением, необходимым для получения изображения.
Нажмите кнопку «Live», чтобы контролировать сигнал, поступающий с камеры. Убедитесь, что флуоресцентный свет включается каждый раз, когда выбирается функция «Live» или «Snap». Перед началом первых измерений следуйте инструкциям, прилагаемым к светоделителю, чтобы выполнить оптическую настройку обоих каналов.

3. Культура клеток и трансфекции

Приготовьте 6-луночные планшеты с автоклавированными круглыми 24-миллиметровыми стеклянными покровными стеклами (1 покровное стекло на лунку).В качестве альтернативы можно использовать чашки для культивирования клеток со стеклянным дном.
Поместите клетки 293A на чашки или чашки в среде D-MEM (с добавлением 10% FCS, 1% L-глутамина и 1% раствора пенициллина / стрептомицина) так, чтобы клетки достигли 50-70% слияния через один день. .
Через 24 часа после посева трансфицировать клетки в стенке с ламинарным потоком сенсорной плазмидой FRET, используя метод трансфекции фосфатом кальция (см. 3.5). Плазмиды биосенсора цАМФ могут быть получены от нашей группы по запросу.Читателя также отсылают к исчерпывающим обзорам ^7,8, описывающим другие доступные биосенсоры цАМФ.
Перед первой трансфекцией клеток подготовьте реагенты для трансфекции. Приготовьте 2,5 M растворы CaCl ₂ и 2xBBS (последний содержит 1,5 мМ Na ₂ HPO ₄, 50 мМ BES, 280 мМ NaCl, довести pH до 6,95 с помощью NaOH) в деионизированной воде. Стерильно фильтруйте растворы, используя обычный фильтр 0,2 мкм.
Для трансфекции 6-луночного планшета или 6 чашек со стеклянным дном смешайте 10 мкг сенсорной плазмиды FRET с 50 мкл 2.5M раствор CaCl ₂ и стерильная вода до 500 мкл. Хорошо смешать.
Добавьте 500 мкл 2x BBS. Хорошо перемешайте и инкубируйте смесь 10 мин при комнатной температуре.
Пипеткой внесите 165 мкл трансфекционной смеси по каплям в каждую лунку или чашку. Аккуратно перемешайте планшет и снова поместите его в инкубатор. Клетки обычно готовы к измерениям FRET через 24 часа после трансфекции. Убедитесь, что на этом этапе клетки не достигли слияния, так как это может повлиять на активность нескольких рецепторов на поверхности клетки.

4. Измерения FRET в живых клетках

Перед первым измерением подготовьте буфер FRET, содержащий 144 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1 мМ MgCl ₂, 2 мМ CaCl ₂, 10 мМ HEPES в деионизированной воде и довести pH до 7,3 с помощью NaOH. Разбавьте соединения, которые будут использоваться в ваших экспериментах по визуализации, с буфером FRET.
Запустите программу обработки изображений. Загрузите ранее определенную конфигурацию системы. Выберите «Файл»> «Загрузить состояние системы», чтобы выбрать ранее настроенное состояние системы.
Установите покровное стекло с адгезивными трансфицированными клетками 293A в камеру для визуализации (, например, Attofluor cell camera). Промойте клетки один раз буфером FRET и добавьте 400 мкл буфера FRET. При использовании чашек для культивирования клеток со стеклянным дном промойте прилипшие клетки и добавьте 2 мл буфера на чашку. Мы проводим все измерения при комнатной температуре в буфере FRET, содержащем HEPES, поэтому контроль CO ₂ не требуется.
Нанесите немного иммерсионного масла на объектив и перенесите камеру формирования изображений на микроскоп.Сфокусируйтесь на клеточном слое, используя просвечивающий свет.
Включите люминесцентный свет, нажав кнопку «Live», и выберите ячейку для эксперимента. Выберите ячейку с оптимальным выражением сенсора, что означает, что она не должна быть слишком яркой и не слишком тусклой. Найдя подходящую ячейку, немедленно выключите флуоресцентный свет, чтобы избежать фотообесцвечивания датчика FRET.
Отрегулируйте время экспозиции в «Настройках камеры» (обычно 10-50 мсек) таким образом, чтобы обеспечить хорошее соотношение сигнал / шум полученного изображения после нажатия кнопки «Snap».Слишком долгое время возбуждения может привести к фотообесцвечиванию, а слишком короткое — к низкому качеству изображения.
Нажмите кнопку «Multi-D Acq.» и установите количество временных точек и временной интервал для получения изображения. Для нашего датчика cAMP-FRET мы получаем одно изображение каждые 5 секунд.
Начните измерения, нажав кнопку «Acquire».
Во время любого измерения можно использовать подключаемый модуль «FRET online» (доступен в Online Supplement , все подключаемые модули должны быть скопированы в папку «plugins» вашего программного обеспечения Micro-Manager перед его запуском ) для отслеживания изменений коэффициента FRET в режиме онлайн.Запустите этот плагин и выберите интересующую область на изображении с соотношением FRET, используя инструмент «Произвольное выделение». Добавьте регион в менеджер ROI и нажмите кнопку «Получить среднее» в окне «Анализатор временных рядов». Отобразится график соотношения FRET. Чтобы обновить график во время измерения, запустите плагин «FRETratioOnline2» и нажмите кнопку «GetAverage».
Как только соотношение FRET достигнет стабильной базовой линии, нанесите желаемое соединение, аккуратно нанеся его пипеткой в чашку / камеру.Для обработки клеток фармакологическими соединениями на этом этапе можно использовать перфузионную систему вместо простого пипетирования.
После завершения эксперимента сохраните стопку покадровых изображений. Снимите измерительную камеру с микроскопа и очистите объектив тканью для объектива.
Вернитесь к шагу 4.3, чтобы повторить измерение с новым образцом.

5. Анализ данных в автономном режиме

Данные изображений FRET можно анализировать в автономном режиме в любое время после эксперимента с помощью программного обеспечения ImageJ.В качестве дополнения к этому протоколу мы предоставляем плагин «FREToffline», используемый в нашей лаборатории для разделения полученных изображений на донорные и акцепторные каналы и для измерения интенсивности флуоресценции в нескольких областях, представляющих интерес. Эти значения интенсивности можно в дальнейшем скопировать в электронную таблицу Excel или Origin для расчета скорректированного отношения FRET. Для визуализации изменений FRET мономолекулярных биосенсоров часто используется простая ратиометрия. В этом случае возбуждается только донорный флуорофор (CFP), и делаются два изображения на пиках эмиссии CFP и YFP.Вычисленное соотношение YFP / CFP (иногда также называемое соотношением FRET / CFP) представляет собой степень FRET между двумя флуорофорами. В мономолекулярных биосенсорах количество фрагментов CFP и YFP одинаково, так что простой ратиометрии достаточно для представления эффективности FRET ¹².

Используйте программу ImageJ, чтобы открыть файл эксперимента, выбрав Плагины> Микро-менеджер> Открыть файл микро-менеджера.
Запустите плагин «FREToffline», который разбивает стек покадровой съемки на отдельные каналы CFP и YFP.
Если требуется коррекция фона, это можно выполнить с помощью программного обеспечения ImageJ.
Щелкните стопку изображений YFP и выберите одну или несколько областей интереса с помощью инструмента «Произвольное выделение» и добавьте их в окно плагина «MultiMeasure», нажав кнопку «Добавить».
Выберите интересующие области в окне «MultiMeasure» и нажмите «Multi», чтобы получить таблицу со средними значениями серого для каждого кадра и каждой области.Скопируйте данные в буфер обмена, выделив все с помощью Ctrl + A и нажав Ctrl + C. Откройте электронную таблицу Excel или Origin и вставьте данные, нажав Ctrl + V. Измерения, выполняемые программой, можно настроить в разделе «Анализ»> «Установить измерения», где вы можете определить параметры для измерения. Обычно в этом диалоге мы выбираем только «Среднее значение серого».
Щелкните стопку изображений CFP. Выполните то же, что описано в 5.5. Вставьте данные об интенсивности CFP в ту же таблицу Excel или Origin.
С помощью программного обеспечения Excel или Origin рассчитайте скорректированный коэффициент FRET. Когда визуализируются простые одноцепочечные мономолекулярные биосенсоры, мы корректируем только перетекание донорной флуоресценции в акцепторный канал. В этом случае скорректированное соотношение акцептор / донор составляет: Отношение = (YFP — B x CFP) / CFP, где B — поправочный коэффициент, который может быть определен путем трансфекции клеток плазмидой CFP и измерения процента флуоресценции донора в YFP. канал (B = YFP / CFP).Пропуск этой поправки для мономолекулярных биосенсоров возможен, поскольку это повлияет только на общую амплитуду ответа FRET без какого-либо качественного влияния на форму кривой.

6. Результаты представителя

На рис. 1 показан пример полностью собранной установки формирования изображений FRET, состоящей из инвертированного микроскопа Nikon, CoolLED, DV2 DualView и камеры Hamamatsu ORCA-03G CCD. Чтобы установить связь между аппаратными компонентами и компьютером, плата ввода-вывода Arduino подключается к компьютеру и к CoolLED, как показано на Рис. 2 .Для синхронного управления источником света и захвата изображения камерой необходимо установить и правильно настроить программное обеспечение Micro-Manager (см. , рис. 3, ). Это бесплатное программное обеспечение можно легко адаптировать к индивидуальным экспериментальным потребностям, добавив необходимые плагины. На фиг. 4A показана репрезентативная необработанная кривая соотношения FRET при измерении с использованием датчика цАМФ Epac1-camps ¹³, экспрессированного в клетках 293A, для мониторинга эффектов β-адренергического агониста изопротеренола, применяемого в момент времени 150 с, и β-блокатора пропранолола. добавляется в момент времени 300 секунд (выполняется, как описано в 4.3-4.10). Эти данные могут быть проанализированы в автономном режиме и скорректированы на утечку CFP в канал YFP, как описано в 5.1-5.7, чтобы получить скорректированный график отношения FRET, показанный на Рис. 4B . Этот репрезентативный эксперимент показывает медленное снижение отслеживаемого отношения FRET после обработки изопротеренолом, что указывает на увеличение внутриклеточного цАМФ. Пропранолол как β-блокатор обращает сигнал изопротеренола, что приводит к снижению цАМФ до базального уровня. Эти изменения в сигнале FRET можно отслеживать в режиме онлайн во время любых экспериментов (как описано в 4.9). Такие эксперименты можно проводить с помощью множества широко используемых биосенсоров, предназначенных для мониторинга различных вторичных мессенджеров или биохимических процессов.

Рис. 1. Схема установки FRET для визуализации, состоящей из CoolLED, инвертированного микроскопа Nikon, DV2 DualView и камеры ORCA-03G CCD.

Рис. 2. Плата ввода-вывода Arduino и ее соединения. Плата помещена в самонастраивающийся пластиковый ящик. Стандартный кабель BNC соединяет светодиод с контактами 8 и GND (0) платы.

Рисунок 3. Скриншоты, демонстрирующие интеграцию компонентов системы с помощью Мастера настройки оборудования. A ) Запустите мастер настройки оборудования. B ) Добавьте необходимые устройства, как указано в 2.3. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рисунок 4. Типичный эксперимент FRET, который измеряет уровни цАМФ в клетках 293A, трансфицированных Epac1-camps. Сначала клетки стимулировали β-адренергическим агонистом изопротеренолом (100 нМ, на 30-й рамке или 150 с) для увеличения цАМФ (наблюдаемого как уменьшение отношения YFP / CFP FRET).Затем клетки обрабатывали β-блокатором пропранололом (10 мкМ, на 60 кадре или 300 с), что приводит к увеличению отношения FRET, отражающему снижение цАМФ. A ) Сырая онлайн-кривая соотношения FRET из одной интересующей области, соответствующей отдельной клетке, отслеживаемой во время эксперимента. B ) Скорректированная кривая отношения после автономного анализа данных, выполненного, как описано в 5.1-5.7.

Обсуждение

в этом протоколе мы демонстрируем, как построить простую недорогую, но мощную систему визуализации FRET для повседневных приложений с различными доступными биосенсорами.Представленная здесь система предназначена для CFP и YFP или аналогичных типов флуоресцентных белков в качестве донорно-акцепторной пары. Между тем, становятся доступны другие индивидуальные биосенсоры, которые используют, например, зеленые и красные флуоресцентные белки ¹⁴. Чтобы адаптировать описанную систему к другим цветам, следует выбрать соответствующие источники света и / или наборы фильтров. В случае светодиода может использоваться другая одиночная светодиодная линия, например, 490 нм, для возбуждения зеленого флуоресцентного белка. Одноволновые светодиоды можно легко (за секунды) демонтировать и заменить.В качестве альтернативы доступны светодиодные матрицы, которые содержат несколько линий для возбуждения различных флуоресцентных белков (, например, pE-2 CoolLED). Чтобы сделать возможным измерения с альтернативными парами FRET, в микроскоп можно поместить другие кубики флуоресцентных фильтров и, в конечном итоге, следует заменить светоделительные фильтры. Photometrics предлагает дополнительные ползунки фильтра излучения для DV2 DualView. Некоторые недавно разработанные приложения используют два или более биосенсоров одновременно для мониторинга нескольких процессов одновременно, например цАМФ и цГМФ вместе в одной ячейке ¹⁵.В этом случае можно использовать QuadView (Photometrics), содержащий четыре канала излучения, затем можно адаптировать подключаемый модуль ImageJ для разделения и анализа изображений для использования с четырьмя каналами и для расчета двух соотношений FRET. Программное обеспечение ImageJ очень гибкое с точки зрения анализа изображений и онлайн-представления результатов. Простые плагины с редактированием текста позволяют адаптировать алгоритм программного обеспечения к потребностям любой отдельной системы визуализации и эксперимента. Иногда это бывает очень полезно и предлагает быстрые решения технических проблем, которые могут потребовать длительного времени, когда они должны быть внедрены в любой коммерческий программный пакет.

При проведении экспериментов FRET крайне важно избегать фотообесцвечивания, которое появляется, когда время возбуждения слишком велико или когда изображения снимаются слишком часто. В этом случае может происходить индуцированное фотонами химическое повреждение или ковалентные модификации флуорофоров, снижающие эффективность FRET. Чтобы избежать фотообесцвечивания, можно уменьшить время экспозиции и частоту получения изображений. Также существуют протоколы ^12,16 для исправления этого явления. Во время анализа данных можно скорректировать перекрестные помехи между донорскими и акцепторными каналами (сквозное проникновение).При использовании мономолекулярных биосенсоров FRET (в этом случае донорные и акцепторные флуорофоры всегда выражаются на одном уровне) для простых ратиометрических измерений может быть достаточно, чтобы скорректировать только просачивание донора в акцепторный канал или даже полностью пропустить эту коррекцию, поскольку это не влияет качественно на форму кривой отношения FRET. Просачивание акцептора в донорный канал обычно незначительно. Когда используются бимолекулярные биосенсоры, состоящие из двух разных белков, они могут экспрессироваться на разных уровнях.В этом случае также рекомендуется коррекция проступания и дополнительная коррекция прямого возбуждения YFP светом 440 нм. Пожалуйста, обратитесь к опубликованному протоколу ¹², где все процедуры исправления описаны более подробно. Дополнительная исчерпывающая информация о разработке биосенсоров, FRET микроскопии, возможных подводных камнях техники и об анализе данных доступна в ранее опубликованных протоколах ^17-18. В заключение, простая и мощная система визуализации, описанная здесь, обеспечивает гибкую платформу для мониторинга различных биохимических событий и сигнальных молекул с высоким временным и пространственным разрешением в живых клетках.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларировался.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Анке Рюттгерот и Карине Циммерманн за техническую помощь. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (грант NI 1301 / 1-1 для V.O.N) и Медицинским центром Геттингенского университета (грант «pro futura» для V.O.N.).

Ссылки

Zaccolo M. Использование химерных флуоресцентных белков и резонансного переноса энергии флуоресценции для мониторинга клеточных ответов.Circ. Res. 2004. 94: 866–873. [PubMed] [Google Scholar]
Мехта С., Чжан Дж. Репортаж с мест: генетически закодированные флуоресцентные репортеры раскрывают динамику передачи сигналов в живых биологических системах. Анну. Rev. Biochem. 2011; 80: 375–401. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Zhang J, Campbell RE, Ting AY, Tsien RY. Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002; 3: 906–918. [PubMed] [Google Scholar]
Мияваки А. Визуализация пространственной и временной динамики внутриклеточной передачи сигналов.Dev. Клетка. 2003. 4: 295–305. [PubMed] [Google Scholar]
Бунеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. Активация белка Gi в интактных клетках связана с перестройкой субъединиц, а не с диссоциацией. Proc. Natl. Акад. Sci. США 2003; 100: 16077–16082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Котликофф М.И. Генетически закодированные индикаторы Ca2 +: использование генетики и молекулярного дизайна для понимания сложной физиологии. J. Physiol. 2007; 578: 55–67. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Уиллоуби Д., Купер Д.М.Визуализация динамики цАМФ на живых клетках. Nat. Методы. 2008; 5: 29–36. [PubMed] [Google Scholar]
Николаев В.О., Лозе MJ. Мониторинг синтеза и деградации цАМФ в живых клетках. Физиология (Bethesda) 2006; 21: 86–92. [PubMed] [Google Scholar]
Танимура А. Использование биосенсоров на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии для количественного анализа динамики инозитол-1,4,5-трифосфата при колебаниях кальция. J. Biol. Chem. 2009; 284: 8910–8917. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Николаев В.О., Лозе MJ.Новые методы мониторинга цГМФ в живых клетках в реальном времени. Handb. Exp. Pharmacol. 2009. С. 229–243. [PubMed]
Науш Л.В., Леду Дж., Бонев А.Д., Нельсон М.Т., Достманн В.Р. Дифференциальное формирование паттерна цГМФ в гладкомышечных клетках сосудов, выявленное с помощью отдельных биосенсоров, связанных с GFP. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2008 г .; 105: 365–370. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Borner S. FRET измерения внутриклеточных концентраций цАМФ и проницаемости аналога цАМФ в интактных клетках.Nat. Protoc. 2011; 6: 427–438. [PubMed] [Google Scholar]
Николаев В.О., Бунеманн М., Хайн Л., Ханнавакер А., Лозе М.Дж. Новые одноцепочечные сенсоры цАМФ для рецептор-индуцированного распространения сигнала. J. Biol. Chem. 2004. 279: 37215–37218. [PubMed] [Google Scholar]
Hong KP, Spitzer NC, Nicol X. Улучшенный набор молекулярных инструментов для исследований цАМФ в живых клетках. BMC Res. Заметки. 2011; 4: 241–24. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Niino Y, Hotta K, Oka K. Одновременная визуализация живых клеток с использованием двойных датчиков FRET с одним возбуждающим светом.PLoS One. 2009; 4: e6036. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Палмер А.Е., Цзянь Р.Я. Измерение передачи сигналов кальция с помощью генетически ориентированных флуоресцентных индикаторов. Nat. Protoc. 2006; 1: 1057–1065. [PubMed] [Google Scholar]
Brumbaugh J, Schleifenbaum A, Stier G, Sattler M, Schultz C. Одно- и двухпараметрические зонды киназы FRET на основе плекстрина. Nat. Protoc. 2006; 1: 1044–1055. [PubMed] [Google Scholar]
Аоки К., Мацуда М. Визуализация активности малых ГТФаз с помощью биосенсоров на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии.Nat. Protoc. 2009; 4: 1623–1631. [PubMed] [Google Scholar]

Пары FRET на основе флуоресцентного белка с улучшенным динамическим диапазоном для измерения времени жизни флуоресценции

Abstract

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) с использованием вариантов флуоресцентных белков широко используется для изучения биохимических процессов в живых клетках. Обнаружение FRET путем измерения времени жизни флуоресценции является наиболее прямым и надежным методом измерения FRET. Традиционные пары FRET на основе голубовато-желтого флуоресцентного белка заменяются зелено-красными вариантами флуоресцентного белка.Зелено-красная пара обеспечивает возбуждение на более длинной длине волны, что снижает аутофлуоресценцию и фототоксичность клеток при мониторинге FRET. Несмотря на достижения в области сенсоров на основе FRET, низкая эффективность и динамический диапазон FRET по-прежнему затрудняют их использование в клеточной биологии и высокопроизводительном скрининге. В этой статье мы использовали более продолжительное время жизни NowGFP и проверили варианты красных флуоресцентных белков для разработки пар FRET с высоким динамическим диапазоном и эффективностью FRET. Вариации FRET анализировали по протеолитической активности и выявляли измерениями с постоянным и временным разрешением.Основываясь на результатах, NowGFP-tdTomato и NowGFP-mRuby2 показали высокий потенциал в виде пар FRET с большим динамическим диапазоном времени жизни флуоресценции. Измерения in vitro и показали, что NowGFP-tdTomato имеет самый высокий радиус Ферстера для любых пар FRET на основе флуоресцентных белков, которые когда-либо использовались в биологических исследованиях. Разработанные пары FRET будут полезны для разработки датчиков на основе FRET и исследований с использованием флуоресцентной микроскопии с визуализацией на протяжении всей жизни (FLIM).

Образец цитирования: Джордж Абрахам Б., Саркисян К.С., Мишин А.С., Сантала В., Ткаченко Н.В., Карп М. (2015) Пары FRET на основе флуоресцентных белков с улучшенным динамическим диапазоном для измерения времени жизни флуоресценции.PLoS ONE 10 (8): e0134436. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436

Редактор: Курт И. Андерсон, Институт исследований рака им. Битсона, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО

Поступила: 13 мая 2015 г .; Одобрена: 9 июля 2015 г .; Опубликован: 3 августа 2015 г.

Авторские права: © 2015 Джордж Абрахам и др. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и вспомогательные информационные файлы к нему.

Финансирование: Высшая школа LASKEMO признана за финансовую поддержку BGA. МК выражает признательность за финансирование этого творческого года Фондом культуры Финляндии (Suomen Kulttuurirahasto). КСС и АНМ поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (грант 13-04-01878-А). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) между флуоресцентными белками стал популярным инструментом для изучения локализации белков и биохимических условий внутри живой клетки. Обычно для исследований FRET широко используются голубой и желтый варианты флуоресцентных белков. С развитием оранжевого и красного вариантов флуоресцентных белков пары FRET Cyan-Yellow заменяются, так как возбуждение и излучение с большей длиной волны приводит к снижению аутофлуоресценции клеток, снижению фототоксичности и меньшему рассеянию света [1,2].Кроме того, голубая и желтая пара FRET демонстрируют заметные перекрестные помехи, которые приводят к проблематичному спектральному разделению, а низкий динамический диапазон FRET (изменение соотношения эмиссии донора / акцептора) ограничивает ее применение, когда внутриклеточные ответы являются тонкими или временными [2,3]. Варианты флуоресцентных белков с круговой перестановкой [4] и оптимизация линкеров [5,6] в некоторой степени улучшают динамический диапазон FRET, но для устранения недостатков современных датчиков на основе FRET требуется использование новых улучшенных флуоресцентных белков в качестве пар FRET.

Метод обнаружения FRET также имеет решающее значение для получения точной информации. FRET может быть обнаружен методами, основанными на интенсивности и времени жизни флуоресценции [7,8]. Методы обнаружения на основе интенсивности чувствительны к изменениям концентрации зонда и длины оптического пути [9,10]. Кроме того, необходимы процедуры калибровки и коррекции, чтобы преодолеть изменения концентрации, спектральное просачивание, обратное просачивание и фотообесцвечивание [11–14]. Метод, основанный на времени жизни флуоресценции, не зависит от концентрации зонда и длины оптического пути [15].Он менее чувствителен к оптической плотности образца, рассеянию, спектральному просвечиванию и фотообесцвечиванию, что делает его одним из наиболее прямых методов измерения FRET [10,16]. Взятые вместе, микроскопия с визуализацией времени жизни флуоресценции (FLIM) является превосходным методом определения FRET в клеточной биологии. Для измерения времени жизни с использованием флуоресцентных белков типичное время жизни флуоресцентных белков составляет от 1,9 до 4 нс. Использование флуоресцентных белков с длительным сроком жизни может улучшить динамический диапазон датчиков FRET в FLIM [15].NowGFP — это улучшенная версия зеленого флуоресцентного белка WasCFP с хромофором на основе триптофана в анионном состоянии и временем жизни флуоресценции ~ 5 нс. Это самое продолжительное время жизни флуоресценции, о котором сообщалось для любого варианта зеленого флуоресцентного белка [17]. Во внутриклеточных условиях время жизни NowGFP сократилось до 4–4,5 нс. Несмотря на это сокращение, это самый продолжительный срок жизни зеленого варианта GFP, и его можно визуализировать одновременно с другим GFP с высоким контрастом времени жизни [18].Помимо самого продолжительного времени жизни, этот вариант флуоресцентного белка на 30% ярче, чем EGFP, и имеет молярный коэффициент экстинкции 56700 M ^-1 см ^-1 с высоким квантовым выходом излучения (0,76), что делает его отличным потенциальным донором для FRET. и FLIM [18].

В этом исследовании мы использовали эти превосходные свойства NowGFP для разработки новых пар FRET с высоким динамическим диапазоном. FRET между вариантами NowGFP и красного флуоресцентного белка (RFP) изучали путем создания пар FRET, слитых с линкером, содержащим сайт расщепления протеазой тромбина.FRET был изучен с использованием стационарного метода счета одиночных фотонов с временным разрешением (TCSPC) и методов спектроскопии FLIM.

Материалы и методы

Построение пар FRET

Методы молекулярной биологии были выполнены, как описано [19]. Пары FRET были созданы путем клонирования сайта расщепления тромбиновой протеазой и вариантов красного флуоресцентного белка в вектор NowGFP / pQE-30, генерирующий пару FRET вариантов NowGFP-GGGSLVPRGS-RFP. Аминокислотная последовательность NowGFP представлена на (S1 фиг.).В данном исследовании использовались варианты красного флуоресцентного белка: mRuby2 (плазмида Addgene 49089, депонировано Куртом Бимом), mOrange (плазмида Addgene 29770, депонировано Скоттом Градиа), tdTomato (плазмида Addgene 18879, депонировано Робертом Кэмпбеллом [20] и TagRFP ( Евроген). Сайт расщепления тромбина (LVPR) фланкирован аминокислотными линкерами GGGS и GS на N-конце и C-конце, соответственно, и весь регион был синтезирован путем добавления последовательности к праймеру, используемому для амплификации NowGFP из NowGFP-pQE- 30 вектор.Варианты красных флуоресцентных белков были амплифицированы с помощью ПЦР, и амплифицированный продукт содержал перекрывающуюся область сайта расщепления тромбина на 5 ’конце и сайта Hind III на 3’ конце. Перекрывающаяся область и сайт рестрикции были созданы путем добавления соответствующих последовательностей к праймерам. Полную последовательность для конструкций FRET затем генерировали с помощью ПЦР с перекрывающимся удлинением, и продукты клонировали в вектор pQE-30 с использованием сайта EcoR I / Hind III.Последовательности праймеров и детали ПЦР представлены в таблицах S1 и S2. Полученные окончательные конструкции: NowGFP-GGGSLVPRGS-mRuby2 (NowGFP-mRuby2), NowGFP-GGGSLVPRGS-mOrange (NowGFP-mOrange), NowGFP-GGGSLVPRGS-tdTomato (NowGFP-tdGFPGFP). Конструкции с одиночными флуоресцентными белками были также получены путем клонирования продукта, амплифицированного с помощью ПЦР, соответствующего флуоресцентному белку, в вектор pQE-30 с использованием сайтов BamH 1/ Hind III. Была создана контрольная конструкция с парой FRET NowGFP-mRuby2, и в этой конструкции отсутствует сайт расщепления тромбином (вместо LVPR конструкция имеет LVPS).Конструкции вводили в клетки Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene, США) путем электропорации. Все плазмиды были проверены секвенированием.

Производство и характеристика белков

Для производства белка клетки культивировали в среде LB с низким содержанием соли (10 г / л триптона, 5 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / л NaCl, pH 7,0) с соответствующими антибиотиками при 37 ° C и 300 об / мин в ферментере. (1 л) (Biostat-B plus, Sartorius BBI systems, GmbH). Используемые антибиотики: 50 мкг / мл ампициллина (для клеток с вектором pQE-30) и 25 мкг / мл хлорамфеникола (для клеток с вектором pAK400c).Получение и очистку белка проводили, как описано ранее [21]. Очищенный белок заменяли буфером с колонками NAP (Sephadex G-25, Novagen) на буфер для расщепления, содержащий 10 мМ Трис (pH 8,0), 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA.

Протеолитическая активность и

in vitro флуоресцентная спектроскопия

Протеолитическую активность анализировали добавлением 10 единиц тромбина NIH (Sigma, США) к конструкциям FRET, которые заменяли буфером для расщепления.Измерения испускания флуоресценции проводились через разные интервалы времени в течение одного часа. Измерения флуоресценции проводили на флуорометре Fluorolog-3-111 (ISA-JobinYvon, Франция). Спектры излучения были скорректированы с использованием функции коррекции, предоставленной производителем, после вычитания темновых импульсов фотоумножителя. Часть расщепленной конструкции FRET, а также необработанной конструкции FRET загружали в SDS-PAGE (Amersham ECL Gel 10% — GE Healthcare Life Sciences) для анализа протеолитической активности.SDS-гель окрашивали раствором PageBlue Protein Staining Solution (Thermo Scientific, США) для наблюдения за белками.

Время жизни флуоресценции было измерено с использованием метода коррелированного по времени счета одиночных фотонов (TCSPC). Используемый инструмент TCSPC состоял из импульсного лазерного диода (LDH-PC-485, PicoQuant, Германия), охлаждаемой многоканальной трубки умножения фотонов (R3809U-50, Hamamatsu, Япония) и модуля TCSPC (PicoHarp 300, PicoQuant Germany), которые объединяют постоянную долю дискриминаторы, преобразователь время-амплитуда (TAC) и многоканальный анализатор (MCA) (PicoQuant, Германия).Образцы возбуждали на длине волны 483 нм с использованием импульсного лазерного диода LDH-P-C-485 с частотой следования импульсов 2,5 МГц. Данные о затухании флуоресценции собирали до тех пор, пока не набралось максимум 10000 отсчетов, с временным разрешением 16 пс и функцией отклика прибора (fwhm) ≈ 100 пс. Эмиссию контролировали при 515 нм, где только донор имеет эмиссию, и использовались отсечные фильтры для предотвращения попадания источника возбуждения в фотоумножитель.

Для экспериментов по фотообесцвечиванию NowGFP и EGFP (в плазмиде pQE-30), экспрессирующие E . coli клеток в фосфатно-солевом буфере (pH-7,4) получали с помощью конфокального инвертированного микроскопа Leica DMIRE2 TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Германия), снабженного масляным объективом 63x. Для возбуждения использовался 488 нм лазер, и мощность лазера была установлена равной 141 мкВт или 23 мкВт. Чтобы измерить скорость фотообесцвечивания, мы взяли серию изображений размером 512 × 512 пикселей со скоростью сканирования 400 Гц.

Анализ FLIM

Для ФИЛЬМА, E . coli клетки, экспрессирующие флуоресцентные белки, помещали на покровное стекло микроскопа, покрытое 2% агарозным гелем в буфере для расщепления.Второе покровное стекло помещали после добавления ячеек для получения однородной поверхности и фиксации ячеек. Анализ отдельных клеток выполняли с использованием флуоресцентного микроскопа на весь срок службы (FLM) MicroTime 200 (PicoQuant) с объективом 100 × (1,49NA, масло). Для возбуждения использовался лазерный диод LDH-P-C483 (PicoQuant), излучающий на длине волны 483 нм, а эмиссию контролировали с помощью детектирующего фильтра 510/20 нм. Изображения были получены с шагом сканирования 0,1 мкм, временным интервалом 5 мс на пиксель и общей площадью сканирования 20 × 20 мкм ².FRET анализировали путем мониторинга времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Анализ данных

Расстояние Ферстера ( R ₀) пар FRET было рассчитано из молярных спектров поглощения и излучения отдельных флуоресцентных белков с использованием уравнения 1 [22] (1) где κ ² — коэффициент ориентации между парой FRET, Q _D — квантовый выход излучения донора, n — показатель преломления среды. κ ² принято равным 2/3 с учетом случайной ориентации флуорофоров, а n — 1,33 (n воды). Дж ( λ ) — это интеграл спектрального перекрытия, который определяется уравнением 2 [22] (2) где F _D — нормированный по пику спектр флуоресценции донора, ε _A — спектр молярного поглощения акцептора как функции длины волны (λ). Значение R ₀ выражено в единицах ангстрем, тогда как ε _A указано в M ^-1 см ^-1, а λ — в нанометрах.

Для измерений TCSPC кривые затухания излучения были подобраны с использованием деконволюции с функцией отклика прибора и применением моделей моно- и биэкспоненциального затухания для определения времени жизни. Расчеты проводились с использованием собственного программного обеспечения (DecFit). Для внутриклеточных измерений с использованием микроскопа времени жизни флуоресценции MicroTime 200 (PicoQuant) анализ изображения и построение кривой выполнялись с использованием поставляемого SymPhoTimev. 4.7 программное обеспечение. Эффективность FRET была рассчитана на основе результатов, полученных путем аппроксимации кривой с использованием уравнения 3 [23]. (3) где τ _DA и τ _D — времена жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Результаты

Оценка пар FRET

Спектр флуоресценции использовался для анализа интеграла спектрального перекрытия ( J ( λ )) и радиуса Ферстера ( R ₀) пар FRET. Флуоресцентные свойства белков, используемых в этом исследовании, а также значения R ₀ и J ( λ ) представлены в таблице 1. Среди четырех изученных вариантов красных флуоресцентных белков NowGFP-tdTomato и NowGFP- Пара mRuby2 FRET демонстрирует более высокое спектральное перекрытие и R ₀. R ₀ этих двух пар FRET больше, чем R ₀ других пар FRET на основе флуоресцентного белка [2,24,25]. Большее значение R ₀ указывает на более высокую вероятность того, что две пары FRET будут использоваться для разработки превосходных датчиков на основе FRET с высоким динамическим диапазоном. Корреляция между более высоким значением R ₀ и FRET была подтверждена по данным стационарной спектроскопии, которые показали более высокий FRET для NowGFP-tdTomato, за которым следует NowGFP-mRuby2 и сравнительно более низкий FRET для NowGFP-TagRFP и NowGFP-mOrange.Для анализа FRET мы использовали последовательность распознавания тромбина (LVPR), включенную между парами FRET. Когда слитые белки возбуждались при 483 нм, когда возбуждается только донор (NowGFP), наблюдалась усиленная эмиссия флуоресценции между 560 нм и 610 нм для различных пар FRET, указывающая на перенос энергии (рис. 1). После добавления тромбина наблюдалось увеличение эмиссии доноров (при 515 нм) с уменьшением эмиссии акцепторов (между 560 и 610 нм), уменьшая FRET.Снижение FRET указывает на расщепление сайта тромбина, приводящее к разделению пар FRET. Расщепление белка началось сразу после добавления тромбина, и изменение ответа FRET указывало на расщепление белка более чем на 90% в течение 30 минут после добавления тромбина (рис. 2). Через 60 минут не было дальнейшего изменения ответа FRET из-за полного расщепления белков. Контрольная конструкция FRET, в которой отсутствует сайт расщепления тромбином, не показала ответа на обработку протеазой, и это подтверждает, что изменение FRET происходит из-за сайт-специфического расщепления тромбином, приводящего к разделению пар FRET.

Рис. 1. Спектры излучения конструкций FRET.

Спектр испускания флуоресценции (при возбуждении 480 нм) конструкций FRET, обработанных тромбином. Схемы конструкций FRET отображаются над спектром. «LVPR» представляет собой последовательность GGGSLVPRGS. Уменьшение FRET во времени в результате протеолитического расщепления можно наблюдать по спектру.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436.g001

Рис. 2. Вариации реакции FRET пар FRET на протеолитическое расщепление во времени.

Контролем является пара FRET NowGFP-mRuby2 без сайта расщепления тромбином (LVPS вместо LVPR). ΔR / R вычислялось как (R ₀ -R _F) / R ₀, где R — соотношение донор: акцептор, а R ₀ — соотношение донор: акцептор при отсутствии FRET и R _F. это коэффициент FRET

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436.g002

Поскольку это исследование направлено на использование более длительного времени жизни флуоресценции NowGFP для создания новых пар FRET, время жизни флуоресценции очищенных конструкций FRET было проанализировано методом TCSPC. .Образцы возбуждали при 483 нм, и за спадом флуоресценции наблюдали при 515 нм. На этой длине волны мониторинга излучает только донор, и ни один из акцепторов не имеет заметного излучения, что позволяет определить время жизни возбужденного состояния донора для всех исследуемых пар. Единичный экспоненциальный распад неслитого NowGFP показал очень долгое время жизни 5,00 нс ± 0,03 нс, что было аналогично времени жизни NowGFP, о котором сообщалось ранее [18]. Время жизни флуоресценции NowGFP в парах FRET после обработки тромбином составляло ~ 4.8–5.0 нс для разных пар FRET. Это указывает на то, что лечение тромбином привело к полному расщеплению пар FRET, уменьшив FRET и восстановив исходное время жизни NowGFP. Кривая затухания флуоресценции слитых конструкций FRET показала значительное уменьшение времени жизни флуоресценции донора, подтверждая эффективный перенос энергии (рис. 3). Для конструкций FRET, подвергнутых FRET, были использованы модели двухэкспоненциальной подгонки для извлечения времени жизни флуоресценции. Средневзвешенное время жизни флуоресценции конструкций FRET (таблица 2) показало более высокий динамический диапазон для пар FRET NowGFP-tdTomato и NowGFP-mRuby2.

Рис. 3. Затухание флуоресценции и совпадения.

Затухание флуоресценции и соответствие пар FRET при длине волны мониторинга 515 нс. На этой длине волны мониторинга можно наблюдать только распад донора. Теперь GFP Fit обозначает время жизни только донора, а FRET-пара-тромбин Fit обозначает время жизни донора после протеолитического расщепления. Тушение времени жизни флуоресценции в результате FRET можно наблюдать по распаду пар FRET. Линии указывают соответствие, а символы соответствующего цвета линии указывают кривую затухания.Полное временное окно спада и подгонок вместе с остатками подгонок показано на S2 Рис.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436.g003

По данным времени жизни флуоресценции, эффективность FRET E NowGFP-tdTomato была самой высокой (0,59) (таблица 2). Следует отметить, что такая высокая эффективность FRET может варьироваться в зависимости от размера и гибкости линкера, а также в зависимости от ориентации диполя [26]. На основании результатов измерения в установившемся режиме и измерения времени жизни флуоресценции NowGFP-tdTomato и NowGFP-mRuby были выбраны для дальнейших исследований, таких как анализ FLIM.

Результаты SDS-PAGE дополнительно подтверждают, что изменение флуоресцентного ответа при добавлении тромбина действительно связано с сайт-специфическим протеолитическим расщеплением тромбином. Анализ SDS-PAGE (фиг. 4) показал полосы отщепленного белка с соответствующей молекулярной массой. Полоса слитого белка не была обнаружена на образцах, обработанных тромбином. В образцах без обработки тромбином полосы слитого белка были очевидны, в то время как видимые полосы не были обнаружены при молекулярных массах, соответствующих расщепленным белкам.Это подтверждает протеолитическую активность и подтверждает, что изменение флуоресцентного ответа происходит исключительно из-за протеолитической активности.

Рис. 4. SDS PAGE, демонстрирующий протеолитическую активность.

Отсутствие полосы слитого белка и присутствие полосы расщепленного белка видно на дорожках 2 и 4, подтверждая протеолитическое расщепление. Пунктирные стрелки указывают на продукт расщепления, а прямая стрелка указывает на полосу слитого белка.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0134436.g004

Одним из ограничений использования NowGFP в измерениях FRET на основе интенсивности является более высокая скорость фотообесцвечивания, наблюдаемая для NowGFP по сравнению с EGFP в in vivo (рис. 5) и in vitro [18] анализ фотообесцвечивания. Однако при уменьшении интенсивности лазерного излучения скорость фотообесцвечивания NowGFP значительно снижается и эквивалентна фотообесцвечиванию EGFP. Также было показано, что NowGFP можно визуализировать при умеренной интенсивности света (менее ~ 0.05 Вт / см ²) для получения изображений с хорошим разрешением в конфокальном режиме [18]. Тем не менее, скорость фотообесцвечивания должна быть принята во внимание для использования NowGFP в измерениях на основе интенсивности, особенно для измерений, включающих длительное и высокоинтенсивное облучение. Однако это не должно влиять на измерения времени жизни флуоресценции, поскольку FLIM обычно выполняется при очень низком уровне возбуждающего света, что минимизирует фотообесцвечивание [8,27]. Предыдущие исследования показали, что не было изменений во времени жизни флуоресценции для вариантов флуоресцентных белков из-за фотообесцвечивания от возбуждающего света в FLIM [27,28].Точно так же мы не наблюдали никаких изменений времени жизни флуоресценции NowGFP в методах TCSPC и FLIM во время наших экспериментов, что делало NowGFP подходящим для исследований на основе времени жизни флуоресценции.

Рис. 5. Фотообесцвечивание NowGFP и EGFP в E . coli клеток.

Бактериальные клетки, экспрессирующие флуоресцентные белки, возбуждали лазером с длиной волны 488 нм, и фотообесцвечивание анализировали по изображениям, полученным с помощью конфокального микроскопа, оснащенного масляным объективом 63x.Разницу в фотообесцвечивании NowGFP и EGFP при разной мощности лазера (141 мкВт и 23 мкВт) можно наблюдать из рисунка.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436.g005

Внутриклеточные измерения

Для оценки FRET внутри живых клеток конструкции были экспрессированы в E . coli клеток. После инкубации в течение ночи во всех культивациях наблюдалась яркая флуоресценция. Дальнейшая инкубация не привела к заметной разнице во флуоресценции, которая указывает на полное сворачивание как донорных, так и акцепторных флуоресцентных белков.Для внутриклеточных исследований FRET анализировали с помощью FLIM, сравнивая клетки, экспрессирующие только донора, с клетками, экспрессирующими пару FRET. Уменьшение времени жизни донора избирательно фиксировалось полосовым фильтром флуоресценции (510/20 нм), который пропускает только излучение донора и блокирует излучение акцепторов. Это было очевидно из FLIM одного акцептора, который не показал испускания красного флуоресцентного белка. Дальнейшее подтверждение было получено из стационарного спектра флуоресценции очищенного mRuby2 или tdTomato, поскольку эмиссии ниже 525 нм обнаружены не были.

Высокий квантовый выход и яркость NowGFP позволили использовать возбуждение низкой интенсивности, что помогает уменьшить проблемы, связанные с фотообесцвечиванием флуоресцентных белков. Согласно измерениям FLIM, время жизни флуоресценции in vivo NowGFP составило 4,04 нс (рис. 6). В изученных парах FRET заметная разница во времени жизни флуоресценции NowGFP наблюдалась в присутствии акцептора, даже несмотря на то, что было обнаружено уменьшение динамического диапазона во внутриклеточных измерениях по сравнению с измерениями in vitro .Время жизни флуоресценции NowGFP было уменьшено до 3,14 нс в паре NowGFP-mRuby2 FRET и 2,80 нс в паре NowGFP-tdTomato FRET (таблица 3). Таким образом, были зарегистрированы высокие in vivo динамических диапазонов для пар FRET по сравнению с предыдущими парами FRET, имеющими сопоставимую длину линкеров [28–31]. На основании измерений в установившемся режиме, TCSPC и FLIM, самая высокая эффективность FRET была получена с парой NowGFP-tdTomato FRET.

Рис. 6. Внутриклеточный FLIM E . coli клеток.

(A) Изображение времени жизни флуоресценции клеток, отображающих FRET. Клетки возбуждают при 483 нм, и избирательное излучение донора отслеживают через полосовой фильтр (510/20 нм). Теперь GFP — это клетки, экспрессирующие только донора, и изменение продолжительности жизни в результате FRET можно наблюдать по клеткам, экспрессирующим пары FRET. Средний срок службы рассчитан примерно для 30 ячеек. Размер изображения 10 мкм × 10 мкм. (B) Кривая затухания флуоресценции клеток, показывающая FRET.Уменьшение времени жизни флуоресценции из-за FRET можно наблюдать по кривой затухания.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436.g006

Таблица 3. Время жизни флуоресценции и эффективность FRET пар FRET внутри бактериальных клеток (из среднего примерно 35 отдельных клеток для каждого флуоресцентного белка / пары ).

E — КПД FRET (рассчитывается согласно уравнению 3). χ2 — рассчитанные стандартные взвешенные наименьшие квадраты для оценки качества соответствия.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436.t003

Обсуждение

Чтобы разработать новые пары FRET с высоким динамическим диапазоном для биологических приложений, мы использовали новое увеличенное время жизни NowGFP и преимущества использования вариантов красных флуоресцентных белков в парах FRET. Четыре варианта красных флуоресцентных белков были выбраны на основе их флуоресцентных свойств и спектрального перекрытия с NowGFP для создания следующих пар FRET, NowGFP-mOrange, NowGFP-mRuby2, NowGFP-TagRFP и NowGFP-tdTomato.MOrange, mRuby2 и TagRFP — это мономерные флуоресцентные белки, о которых ранее сообщалось как об отличных акцепторах FRET [2,3,32]. TdTomato представляет собой тандемный димер (два флуоресцентных белка, закодированных в одной открытой рамке считывания), который является одним из самых ярких известных вариантов красного флуоресцентного белка и оказался отличным акцептором FRET с вариантами GFP [20,33]. Другие красные флуоресцентные белки, такие как mRFP и mCherry, здесь не изучались, так как их выбросы очень низкие, чтобы их можно было обнаружить над хвостом излучения донора, что вызывает проблемы при ратиометрической визуализации [2].Включенный сайт узнавания тромбина между флуоресцентными белками позволил нам изучить изменения FRET по ферментативной активности. Физическое разделение пар FRET увеличивает межхромофорное расстояние и, таким образом, снижает эффективность FRET.

Высокий квантовый выход донора, наряду с высоким коэффициентом экстинкции (ε) выбранных акцепторов (таблица 1), является преимуществом, генерирующим лучшие пары FRET [13]. Другие основные критерии, которые рассматривались для создания превосходных пар FRET, включают уменьшение нежелательного перекрытия между выбросами донора и акцептора, увеличение расстояния Ферстера и эффективность FRET, близкую к 0.5. Стационарные измерения показали хорошее разделение между эмиссией донора и акцептора для выбранных пар FRET. Единственным исключением была пара NowGFP-mOrange FRET из-за того, что излучение mOrange значительно перекрывается с излучением NowGFP. MRuby2 продемонстрировал наибольшее разделение донорно-акцепторной эмиссии с NowGFP среди выбранных вариантов флуоресцентного белка, что делает его хорошим кандидатом для анализа FRET с NowGFP в качестве донора.

Значение R ₀ было определено из спектральных данных.Насколько нам известно, R ₀ NowGFP-tdTomato (6,57 нм) является самым большим значением R ₀, о котором сообщалось до сих пор для любых пар FRET на основе флуоресцентных белков, которые еще использовались в приложениях или исследованиях FRET. Наибольшее значение R ₀, о котором сообщалось ранее (6,3 нм), было для Clover-mRuby2 [2]. Для пары NowGFP-mRuby2 зарегистрированное значение R ₀ (6,17 нм) было третьим по величине из зарегистрированных. Сочетание высокого квантового выхода донора, высоких коэффициентов экстинкции акцепторов и большого интеграла перекрытия привело к получению высокого значения R ₀ для этих пар FRET.Высокое значение R ₀ важно, поскольку FRET сильно зависит от R ₀, а эффективность FRET увеличивается с увеличением R ₀ [2,34]. Более высокое значение R ₀ NowGFP-tdTomato и NowGFP-mRuby2 было отражено в измерении FRET, поскольку эти две пары FRET показали более высокую эффективность FRET по сравнению с другими проанализированными парами FRET. Следует также отметить, что максимальная эффективность FRET ограничена физическим размером флуоресцентного белка, поскольку хромофор расположен в центре β-цилиндра, а эффективность FRET зависит от расстояния.Расстояние наибольшего сближения между хромофорами флуоресцентных белков составляет ~ 3–3,1 нм, и это происходит, когда флуоресцентные домены расположены близко друг к другу и в параллельной ориентации [26,35]. Однако в датчике FRET линкер или сенсорный домен дополнительно увеличивают расстояние между парами FRET, и это снижает эффективность FRET. Принимая во внимание этот фактор, эффективность FRET, полученная для NowGFP-tdTomato и NowGFP-mRuby2, достаточно высока для пар FRET на основе флуоресцентного белка, и это можно объяснить его высокими значениями R ₀.

Эффективность FRET и расстояние между флуорофорами связаны сигмоидальной кривой в соответствии с уравнением Ферстера. Кривая имеет наибольший наклон, когда эффективность FRET составляет 0,5 и межхромофорное расстояние близко к R ₀. Из-за этого датчики FRET, работающие с эффективностью FRET, близкой или более 0,5, демонстрируют большое относительное изменение эффективности FRET с изменением межхромофорного расстояния по сравнению с датчиками, у которых эффективность FRET меньше 0.5 [2]. И NowGFP-mRuby, и NowGFP-tdTomato имеют эффективность FRET, близкую к 0,5. Это наряду с высоким радиусом Ферстера пар NowGFP-mRuby2 и NowGFP-tdTomato FRET объясняет большое изменение отношения FRET, наблюдаемое для этих пар FRET при протеолитическом расщеплении, что делает их подходящими парами FRET для разработки сенсоров на основе FRET. Одной из основных проблем использования tdTomato по сравнению с другими вариантами флуоресцентного белка, заявленными ранее, является его объемность (54 кДа), поскольку это тандемный димер [36–38].Напротив, наши результаты ферментативной активности в отношении пары FRET с tdTomato показали, что объем tdTomato не повлиял на кинетику протеолиза по сравнению с результатами, полученными для более мелких мономерных вариантов. Аналогичные результаты были получены ранее при использовании tdTomato в паре FRET [20], что предполагает, что использование tdTomato не повлияет на свойство биочувствительности, когда он используется в качестве акцептора FRET в конструкции биосенсора. Однако в некоторых слияниях tdTomato, как сообщается, вызывает проблемы созревания, и это необходимо учитывать при разработке биосенсоров, которые включают сложные структуры или взаимодействия [29].Несмотря на это, tdTomato является самым ярким красным вариантом, имеет полупериод созревания в один час, успешно используется как для N-, так и для C-концевого слияния, а также в датчиках FRET, что делает его хорошим выбором в качестве акцептора [29,33].

Оценка

FRET в экспериментах FLIM основана только на измерении времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора, что является одним из наиболее прямых и надежных способов анализа FRET [29,32,39]. Большое изменение времени жизни флуоресценции указывает на то, что датчик с большим изменением динамического диапазона FRET.Наше предположение о том, что более длительный срок службы NowGFP может обеспечить больший динамический диапазон для датчика, было подтверждено измерением времени жизни флуоресценции in vitro , которое показало значительное сокращение срока жизни донора для пары NowGFP-tdTomato, за которой следует пара NowGFP-mRuby FRET. Уменьшение времени жизни донора, наблюдаемое в in vitro FRET пары NowGFP-tdTomato FRET, было более чем в 2,6 раза, и это самое высокое изменение, зарегистрированное до сих пор для любых пар FRET на основе флуоресцентного белка.Большее разделение между спектром излучения донора и акцептора было преимуществом, поскольку излучение акцептора не просачивалось через контрольный фильтр, что упрощало выборочный контроль излучения донора. Кроме того, более высокая яркость NowGFP обеспечивает возбуждение низкой интенсивности, уменьшая фотодеградацию во время экспериментов. Значительное изменение срока службы донора при прохождении FRET, наряду с преимуществом наличия большого спектрального разделения излучения и более высокой яркости NowGFP, позволяет использовать NowGFP-tdTomato и NowGFP-mRuby2 в качестве превосходных пар FRET для исследований FLIM.

Внутриклеточный анализ FLIM из E . Клетки coli продемонстрировали существенную разницу во времени жизни флуоресценции, когда NowGFP подвергается FRET, а NowGFP-tdTomato демонстрирует более крупный FRET, аналогичный результатам измерений in vitro . Однако уменьшение времени жизни флуоресценции наблюдалось для NowGFP (только донор) во внутриклеточных измерениях по сравнению со значениями in vitro , и это отразилось на динамическом диапазоне FRET.Было обнаружено, что динамический диапазон FRET был уменьшен при внутриклеточных измерениях по сравнению с измерениями in vitro . Уменьшение времени жизни по сравнению с измерениями in vitro и может быть связано с внутриклеточным микроокружением, которое влияет на время жизни флуоресценции [40]. Более того, исследования показали, что изменение локального микроокружения флуорофора может влиять на время жизни донора и, следовательно, это необходимо учитывать при сравнении времени жизни FRET в различных органеллах образца [41–43].Хотя изменение времени жизни флуоресценции в результате FRET уменьшается по сравнению с измерениями in vitro и , изменение времени жизни флуоресценции in vivo и пары FRET все еще выше по сравнению с ранее сообщенными парами FRET на основе красного флуоресцентного белка [ 3,29,44]. Значительное изменение срока службы FRET новых пар FRET выгодно при разработке улучшенных датчиков на основе FRET, которые переключаются между четко определенными состояниями ВКЛ и ВЫКЛ.

Спектрально схожие варианты GFP, коэкспрессированные в одной и той же клетке, были разделены на основе времени жизни флуоресценции с использованием FLIM [45].Недавно было показано, что сигналы NowGFP и EGFP от одной и той же клетки разделены на основе контраста времени жизни флуоресценции [18]. Следовательно, мы считаем, что более длительный срок службы пары FRET NowGFP-Ruby может предложить возможность FLIM с двумя разными биосенсорами на основе FRET в одной ячейке в сочетании с другими парами FRET, имеющими более короткое время жизни донора (например, пара TagGFP-TagRFP [3]).

Заключение

Новые пары FRET, представленные здесь, показали улучшенный динамический диапазон срока службы FRET и высокую эффективность FRET.Среди четырех проанализированных пар FRET, NowGFP-tdTomato и NowGFP-mRuby2 оказались лучшими парами FRET, что сделало их отличными парами FRET для FLIM и биосенсоров. Несмотря на более высокую яркость и квантовый выход NowGFP по сравнению с EGFP, NowGFP отбеливает быстрее, чем EGFP. Однако NowGFP можно визуализировать при слабом возбуждении, и это уменьшает фотообесцвечивание. Кроме того, перемещение возбуждения с голубого (традиционных пар FRET на основе CFP) в зеленую область уменьшит проблемы фототоксичности в клетках.Спектр флуоресценции NowGFP [18] обеспечивает хорошее перекрытие спектров и разделение спектров излучения с большинством вариантов красных флуоресцентных белков. Все эти преимущества в сочетании с самым продолжительным временем жизни флуоресценции, о котором сообщалось, делают NowGFP хорошим выбором для донора в анализах FRET на основе FLIM. Теперь GFP-tdTomato продемонстрировал наивысшее зарегистрированное значение R ₀ для любой пары FRET на основе флуоресцентного белка, используемой в биологических исследованиях, и это было отражено в анализе FRET, который показал широкий динамический диапазон FRET при измерениях времени жизни флуоресценции.

Новые описанные пары FRET будут подходящим выбором для новых датчиков на основе FRET в анализах FLIM с улучшенным динамическим диапазоном, а также для мониторинга взаимодействий с белками с высоким контрастом. Обнаружение при более длительном сроке службы также предлагает возможность для разработки двойных биосенсоров, позволяющих обнаруживать более чем одно взаимодействие белков одновременно с одной клеткой с помощью FLIM.

Дополнительная информация

S2 Рис. Окно полного времени, показывающее затухание флуоресценции и совпадения.

(A) пар FRET при длине волны мониторинга 515 нс вместе с остатками соответствия (B). Тушение времени жизни флуоресценции в результате FRET можно наблюдать по спаду времени жизни флуоресценции пар FRET.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0134436.s004

(TIF)

Благодарности

Аспирантура ЛАСКЕМО признательна за финансовую поддержку. МК выражает признательность за финансирование этого творческого года Фондом культуры Финляндии (Suomen Kulttuurirahasto).КСС и АНМ поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (грант 13-04-01878-А).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: BGA. Проведены эксперименты: BGA. Проанализированы данные: BGA. Внесенные реактивы / материалы / инструменты анализа: МК НВТ КСС АСМ. Написал бумагу: BGA. Руководил и координировал исследование: VS MK NVT. Эксперимент по фотообесцвечиванию: КСС.

Ссылки

1. Щербакова Д.М., Субач О.М., Верхуша В.В.Красные флуоресцентные белки: передовые приложения для визуализации и дизайн будущего. Angewandte Chemie International Edition 2012; 51 (43): 10724–10738.
2. Эми Дж. Л., Франсуа С., Гонг Й., Джесси Д. М., Паула Дж. К., Мишель А.Б. и др. Улучшение динамического диапазона FRET с помощью ярко-зеленых и красных флуоресцентных белков. Природные методы 2012; 9 (10): 1005–1012. pmid: 22961245
3. Щербо Д., Суслова Е., Годхарт Дж., Чепурных Т., Гайнцева А., Шемякина И. и др. Практичная и надежная пара флуоресцентных белков FRET / FLIM.BMC Biotechnology 2009; 9 (1): 24.
4. Фриц Р.Д., Летцельтер М., Рейман А., Мартин К., Фуско Л., Рицма Л. и др. Универсальный набор инструментов для создания чувствительных биосенсоров FRET для визуализации сигналов во времени и пространстве. Сигнализация науки 2013; 6 (285).
5. Van Dongen EMWM, Evers TH, Dekkers LM, Meijer EW, Klomp LWJ, Merkx M. Вариация длины линкера в ратиометрических флуоресцентных сенсорных белках позволяет рационально настраивать сродство Zn (II) в пикомолярном и фемтомолярном диапазоне.J Am Chem Soc 2007; 129 (12): 3494–3495. pmid: 17335212
6. Колосов В.Л., Spring BQ, Sokolowski A, Conour JE, Clegg RM, Kenis PJA и др. Разработка редокс-чувствительных линкеров для генетически кодированных биосенсоров на основе FRET. Экспериментальная биология и медицина, 1 февраля 2008 г., 233 (2): 238–248. pmid: 18222979
7. Талер С., Кушик С.В., Бланк П.С., Фогель С.С. Количественная многофотонная спектральная визуализация и ее использование для измерения резонансной передачи энергии. Biophys J 2005; 89 (4): 2736–2749.pmid: 16040744
8. Pelet S, Previte MJR, So PTC. Сравнение количественной оценки точности измерения резонансного переноса энергии Фёрстера на основе изображений интенсивности, спектра и времени жизни. Дж. Биомед Опт 2006; 11 (3).
9. Девитт С., Дарли Р.Л., Халлетт МБ. Переезд или просто местонахождение? Псевдоподии влияют на флуоресцентные сигналы. Журнал клеточной биологии, 26 января 2009 г .; 184 (2): 197–203. pmid: 19171754
10. Макгинти Дж., Дансби С., Ауксориус Э., Беннингер РКП, Де Буль П., Элсон Д.С. и др.Глава 4 Многомерная флуоресцентная визуализация. Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии 2009; 33 (0): 133–169.
11. Гордон Г.В., Берри Г., Лян XH, Левин Б., Герман Б. Количественные измерения передачи энергии флуоресцентного резонанса с использованием флуоресцентной микроскопии. Biophys J 1998 5; 74 (5): 2702–2713. pmid: 95
12. Zal T, Gascoigne NRJ. Изображение живых клеток с поправкой на фотообесцвечивание FRET. Biophys J 2004 6; 86 (6): 3923–3939.pmid: 15189889
13. Поршень Д.В., Кремерс Г. Флуоресцентный белок FRET: хорошее, плохое и уродливое. Тенденции Biochem Sci 2007 9; 32 (9): 407–414. pmid: 17764955
14. Чанг К., Ву М., Мераджвер С.Д., Мичек М. Физиологическая микроскопия для визуализации времени жизни флуоресценции улучшает обнаружение резонансного переноса энергии Ферстера в живых клетках. БИОМЕДО 2009; 14 (6): 060502.
15. Ярес-Эриджман Э.А., Йовин ТМ. FRET визуализация. Nat Biotechnol 2003; 21 (11): 1387–1395.pmid: 14595367
16. Зулинг К. Фотофизика флуоресценции. В: Марку Л., французская PMW, Эльсон Д.С., редакторы. Флуоресцентная спектроскопия времени жизни и визуализация — Принципы и приложения в биомедицинской диагностике: CRC Press; 2014. с. Глава 2, 23–46.
17. Саркисян К.С., Ямпольский И.В., Солнцев К.М., Лукьянов С.А., Лукьянов К.А., Мишин А.С. Хромофор на основе триптофана во флуоресцентных белках может быть анионным. Научные отчеты 2012; 2.
18. Саркисян К.С., Горященко А.С., Лидский П.В., Горбачев Д.А., Божанова Н.Г., Гороховатский А.Ю. и др.Зеленый флуоресцентный белок с анионным хромофором на основе триптофана и большим временем жизни флуоресценции. Биофизический журнал: In Press.
19. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, 2-е изд. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор; 1989.
20. Ай Х-, Хейзелвуд К.Л., Дэвидсон М.В., Кэмпбелл РЭ. Пары флуоресцентных белков FRET для ратиометрической визуализации двойных биосенсоров. Природные методы 2008; 5 (5): 401–403. pmid: 18425137
21.Веселов А.А., Абрахам Б.Г., Лемметинен Х., Карп М.Т., Ткаченко Н.В. Фотохимические свойства и сенсорные применения модифицированного желтого флуоресцентного белка (YFP), ковалентно прикрепленного к поверхности протравленных оптических волокон (EOF). Anal Bioanal Chem 2012, январь; 402 (3): 1149–1158. pmid: 22116380
22. Хинк М.А., Виссер Н.В., Борст Дж. В., Ван Хук А., Виссер AJWG. Практическое использование скорректированных спектров возбуждения флуоресценции и эмиссии флуоресцентных белков в исследованиях Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET).Журнал Fluoresc 2003; 13 (2): 185–188.
23. Абрахам Б., Сантала В., Ткаченко Н., Карп М. Флуоресцентный датчик FRET на основе белка для внутриклеточного мониторинга окислительно-восстановительного статуса бактерий на уровне отдельных клеток. Аналитическая и биоаналитическая химия 2014 11/01; 406 (28): 7195–7204. pmid: 25224640
24. Паттерсон Г.Х., Поршневой Д.В., Барисас Б.Г. Расстояния Форстера между парами зеленых флуоресцентных белков. Анальная биохимия 2000; 284 (2): 438–440. pmid: 10964438
25. Акрап Н, Зайдель Т., Барисас Б.Г.Расстояния Ферстера для резонансной передачи энергии флуоресценции между mCherry и другими видимыми флуоресцентными белками. Анальная биохимия, 2010 7/1; 402 (1): 105–106. pmid: 20347671
26. Evers TH, Van Dongen EMWM, Faesen AC, Meijer EW, Merkx M. Количественное понимание передачи энергии между флуоресцентными белками, соединенными гибкими пептидными линкерами. Биохимия (N Y) 2006; 45 (44): 13183–13192.
27. Чен Ю., Периасами А. Характеристика микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции с двухфотонным возбуждением для определения локализации белка.Microsc Res Tech 2004; 63 (1): 72–80. pmid: 14677136
28. Tramier M, Zahid M, Mevel J, Masse M, Coppey-Moisan M. Чувствительность пар CFP / YFP и GFP / mCherry к фотообесцвечиванию доноров при определении FRET с помощью микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции в живых клетках. Microsc Res Tech 2006; 69 (11): 933–939. pmid: 16941642
29. ван Д.К., Огинк Дж., Понсиоен Б., Ялинк К. Сравнение пар донор-акцептор для генетически закодированных датчиков FRET: применение к датчику цАМФ Epac в качестве примера.PLoS ONE 2008 04/02; 3 (4): e1916. pmid: 18382687
30. Бруссард Дж. А., Раппа Б., Уэбб Д. Д., Браун С. М.. Микроскопия флуоресцентного резонансного переноса энергии, продемонстрированная путем измерения активации серин / треонинкиназы Akt. Протоколы природы 2013; 8 (2): 265–281. pmid: 23306460
31. Padilla-Parra S, Audugé N, Lalucque H, Mevel J-, Coppey-Moisan M, Tramier M. Количественное сравнение различных пар флуоресцентных белков для быстрого получения FRET-FLIM.Biophys J 2009; 97 (8): 2368–2376. pmid: 19843469
32. Bayle V, Nussaume L, Bhat RA. Комбинация нового мутантного зеленого флуоресцентного белка TSapphire и варианта mOrange DsRed для создания универсального анализа FRET-FLIM in planta. Физиология растений, сентябрь 2008 г .; 148 (1): 51–60. pmid: 18621983
33. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из Discosoma sp. красный флуоресцентный белок.Nat Biotechnol 2004 Dec; 22 (12): 1567–1572. pmid: 15558047
34. Берни К., Данузер Г. FRET или нет FRET: количественное сравнение. Biophys J 2003; 84 (6): 3992-4010. pmid: 12770904
35. Evers TH, Appelhof MAM, de Graaf-Heuvelmans PTHM, Meijer EW, Merkx M. Ратиометрическое обнаружение Zn (II) с использованием хелатирующих флуоресцентных белковых химер. Журнал Молекулярной биологии 2007; 374 (2): 411–425. pmid: 17936298
36. Шэнер NC, Паттерсон GH, Дэвидсон MW. Достижения в технологии флуоресцентных белков.Journal of Cell Science, 2007 15 декабря; 120 (24): 4247–4260.
37. Эйзенштейн М. Помогаем клеткам рассказать красочную сказку. Печать Nat Meth 2006; 3 (8): 647–655.
38. Пяткевич К.Д., Верхуша В.В. Руководство по красным флуоресцентным белкам и биосенсорам для проточной цитометрии. Методы Cell Biol 2011; 102: 431–461. pmid: 21704849
39. ван Мюнстер Э., Гаделла Т. Флуоресцентная микроскопия для визуализации времени жизни (FLIM). Методы микроскопии 2005; 95: 143–175.
40.Плисс А., Чжао Л., Охульчанский Т.Ю., Цюй Дж., Прасад П.Н. Время жизни флуоресценции флуоресцентных белков как зонда внутриклеточной среды, определяющего развитие клеточного цикла. ACS Chem Biol 2012, 17 августа; 7 (8): 1385–1392. pmid: 22594453
41. Борст Дж. У., Хинк М. А., Ван Хук А., Виссер AJWG. Влияние показателя преломления и вязкости на затухание флуоресценции и анизотропии усиленных голубым и желтым флуоресцентными белками. Журнал Fluoresc 2005; 15 (2): 153–160. pmid: 15883770
42.Sun Y, Day RN, Periasamy A. Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с использованием микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции. Протоколы природы 2011; 6 (9): 1324–1340. pmid: 21886099
43. Suhling K, Siegel J, Phillips D, French PM, Leveque-Fort S, Webb SE и др. Визуализация среды зеленого флуоресцентного белка. Biophys J 2002 Dec; 83 (6): 3589–3595. pmid: 12496126
44. Ллерес Д., Свифт С., Ламонд А.И. Обнаружение белок-белковых взаимодействий in vivo с FRET с использованием микроскопии для визуализации времени жизни многофотонной флуоресценции (FLIM).Curr Protoc Cytom, октябрь 2007 г .; Глава 12: Unit 12.10.
45. Pepperkok R, Squire A, Geley S, Bastiaens PIH. Одновременное обнаружение нескольких зеленых флуоресцентных белков в живых клетках с помощью микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции. Текущая биология 1999; 9 (5): 269–272. pmid: 10074454
46. Мерзляк Е.М., Годхарт Дж., Щербо Д., Булина М.Е., Щеглов А.С., Фрадков А.Ф. и др. Яркий мономерный красный флуоресцентный белок с увеличенным временем жизни флуоресценции. Природные методы 2007; 4 (7): 555–557.pmid: 17572680

Экспрессия биосенсора АТФ на основе FRET в кишечнике C. elegans

Материалы и реагенты Новые методы

Экспрессия биосенсора АТФ на основе FRET в кишечнике C. elegans Кишечник

Хосе Сото1,2,3, Мадлен Ривера1 , 3, Джина Бройтман-Мадуро4,3 и Моррис Ф. Мадуро4,3

1 Бакалавриат по биохимии
2 Программа MARCU-STAR
3 Университет Калифорнии, Риверсайд,
4 Кафедра молекулярной, клеточной и системной биологии

Рисунок 1: A. Принцип работы датчика АТФ на основе FRET, по Zhang et al. , 2018. Когда флуорохромы mApple и Clover не связаны с АТФ, они физически находятся далеко друг от друга. Клевер — это форма зеленого флуоресцентного белка, который возбуждается синим светом и излучает зеленый свет. mApple — это форма красного флуоресцентного белка, который возбуждается зеленым светом и излучает красный свет. Синий возбуждающий свет, используемый для Clover, производит только минимальное возбуждение для мобильных устройств. Однако, когда АТФ связывается, две флуоресцентные части сенсора сближаются, позволяя излучению клевера напрямую возбуждать мАппл посредством FRET.Следовательно, количество красного излучения сенсорного белка из-за синего возбуждения является косвенным измерением доли белка, связанного с АТФ. В качестве контроля возбуждение / испускание частей Clover или mApple может обнаруживать сенсорный белок независимо от его взаимодействия с АТФ. В наших руках обнаружение mApple привело к гораздо более высокому соотношению сигнал / шум из-за более низкой красной автофлуоресценции в кишечнике. B. Получение и анализ изображений. Передняя кишка была визуализирована дважды с помощью объектива 63x.На первом изображении использовалось прямое возбуждение и испускание mApple с использованием набора фильтров TRITC для оценки присутствия сенсорного белка. Второе изображение было получено с использованием набора фильтров FRET. Это позволяет возбуждать клевер, который производит зеленое излучение, которое возбуждает яблоко, которое определяется как красное излучение. Поскольку излучение FRET имеет гораздо меньшую интенсивность, изображение, показанное здесь, было улучшено для контраста. Используя скрипт Python, изображение TRITC использовалось для идентификации блоков размером 100×100 пикселей, которые содержат сенсорный белок, и, следовательно, для определения области интереса (ROI).Значения пикселей были получены в красном канале для изображений TRITC и FRET в ROI, чтобы сгенерировать среднее соотношение значений красных пикселей. Сокращения: ph, глотка; int1, первое кишечное кольцо. C. Гистограммы, показывающие данные для контрольных и тестовых случаев. Планки ошибок обозначают SEM. (а.е. = условные единицы)

Кишечник C. elegans является основным местом генерации и хранения химической энергии. Аденозинтрифосфат (АТФ) является основной молекулой, участвующей в передаче энергии, поэтому регулирование внутриклеточного уровня АТФ является критическим аспектом метаболизма.Недавно сенсорные белки АТФ были использованы для косвенного измерения уровней АТФ в живых клетках (Zhang et al. , 2018). Эти сенсоры получают путем вставки ε-субъединицы бактериальной F ₀ F ₁ -АТФ-синтазы между двумя флуоресцентными белковыми доменами, что позволяет обнаруживать белок, связанный с АТФ, с помощью Förster Resonance Energy Transfer, или FRET (Imamura et al. , 2009 г.). Другие недавно продемонстрировали использование датчиков АТФ на основе FRET в глотке и мышцах C. elegans (Tsuyama et al., 2013; Wang et al. , 2019). Здесь мы тестируем кишечную экспрессию аналогичного датчика АТФ на основе FRET, полученного из пары зеленый / красный флуорохром Clover / mApple (рис. 1A) (Mendelsohn et al. , 2018). Когда белок связывается с АТФ, два флуорохрома сближаются, позволяя излучению клевера возбуждать яблоко (Имамура и др. , 2009; Мендельсон и др. , 2018).

Мы получили трансгенных животных, экспрессирующих сенсор под контролем промотора pept-1 , который в массивах вызывал самую сильную экспрессию в переднем кишечном кольце, int1 (Mendelsohn et al., 2018; Nehrke, 2003). Мы измерили FRET, сравнив красный сигнал в парах изображений, как показано на рисунке 1B. Отдельные взрослые животные были изображены дважды в одной и той же фокальной плоскости. На первом изображении mApple было обнаружено с помощью набора фильтров TRITC, чтобы выявить расположение датчика независимо от уровней АТФ. Второе изображение было получено с использованием набора фильтров для возбуждения Clover и обнаружения красной эмиссии FRET от mApple. Мы разработали конвейер автоматического анализа изображений на Python, чтобы быстро вычислить средние отношения сигнала FRET: mApple для каждой пары изображений и объединить данные по нескольким животным.

Мы проверили три генетических условия, чтобы оценить, производит ли датчик относительные уровни АТФ, аналогичные ранее определенным другими (рис. 1C). Нокдаун кодируемого ядром гена субъединицы АТФ-синтазы atp-3 с помощью РНКи приводит к снижению на 60-80%, а нокдаун daf-2 , увеличению на 100-200% биохимических уровней АТФ в целые животные, в зависимости от их возраста (Dillin et al. , 2002). Напротив, мутация daf-16 практически не меняет уровни АТФ (Braeckman et al., 1999). Мутация daf-2 вызвала умеренное увеличение уровней мышечного АТФ через несколько дней, измеренное аналогичным датчиком АТФ на основе FRET, ATeam (Wang et al. , 2019). Как показано на рис. 1C, наши результаты были качественно аналогичными. Однако различия, наблюдаемые с датчиком, хотя и являются статистически значимыми, имеют меньшую величину, то есть только 40% уменьшение для atp-3 (RNAi) и увеличение на 50% для daf-2 (RNAi) . Таким образом, консервативно, биосенсор in vivo ATP лучше всего использовать для сравнения относительных уровней свободного ATP в разных генотипах и условиях, а не для прямого вывода реальных биохимических изменений.

Наши результаты показывают, что даже при скромной и недорогой установке флуоресценции, репортер in vivo ATP FRET может быть полезным способом измерения аспектов метаболического состояния в кишечнике C. elegans . Улучшение экспрессии репортера и использование конфокальной микроскопии, вероятно, еще больше повысит полезность этой системы.

Запросить подробный протокол

Построение сенсора трансгена . Мы получили плазмиды, кодирующие нормальные и мертвые киназы версии нового слитого белка Clover-ATP-mApple (Mendelsohn et al., 2018). Их использовали для ПЦР и сборки Гибсона для слияния 1407 пар оснований промотора pept-1 с сенсорной кодирующей областью и 3’UTR unc-54 из вектора pPD95.67.

Штаммы и работа с червями. unc-119 (ed4) Мутанты были сделаны трансгенными для сенсора, управляемого пепт-1, и спасательной плазмиды unc-119 (+) , с помощью микроинъекции. Массивы были объединены для создания штамма MS2495, несущего irIs158 (нормальный датчик) и MS2499, несущего irIs162 (датчик с мертвой киназой).РНКи выполняли путем кормления бактерий HT115, несущих пустой вектор, последовательности daf-2 или atp-3 с использованием стандартных методов (Kamath and Ahringer, 2003).

Флуоресцентная микроскопия. Передний отдел кишечника взрослых в возрасте 1-2 дней был визуализирован на прямом эпифлуоресцентном микроскопе Olympus BX-51, оснащенном ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт и камерой Canon EOS 77D с адаптером LMScope C-mount. MApple детектировали с помощью набора фильтров Chroma 31002 TRITC.Для обнаружения FRET мы объединили возбудитель HQ500 / 20x и светоделитель Q515lp из набора фильтров Chroma 41029 YFP с полосовым эмиссионным фильтром 635/20 (подарок доктора Дэвида Картера, UCR Microscopy Core). Чтобы свести к минимуму вариабельность интенсивности флуоресценции, изображения для серии экспериментов были получены в течение короткого времени с использованием одной и той же ртутной лампы и настроек.

Анализ изображений . Изображения размером 2656 × 3984 пикселей были сделаны при ISO 100 и выдержке ¼ секунды и сохранены в формате JPG с помощью Canon Digital Photo Professional.В наших первых исследованиях мы открывали пары изображений как слои в Adobe Photoshop и использовали контрольное изображение TRITC для определения интересующей области. Затем мы извлекаем значения пикселей этой области из обоих изображений. Мы разработали скрипт Python для автоматической обработки пар изображений (доступен по адресу https://github.com/MaduroMF/FRETcalc/releases/tag/1.0). Сценарий разделяет первое изображение на блоки размером 100 × 100 пикселей, и если среднее значение красного пикселя блока выше, чем фон 50, средние значения красного пикселя записываются из того же блока между контрольным изображением и изображениями FRET.Для каждой пары изображений программа вычисляет как среднее из соотношений, полученных по интересующим областям, так и отношение средних значений пикселей. Для гистограммы, показанной на рисунке, последняя использовалась для вычисления средних значений, стандартной ошибки и значений p с использованием двустороннего теста t . Значения соотношения пикселей ( r ) были масштабированы для гистограммы путем вычисления ( r -0,04) / 0,04 * 100. Отношение за вычетом 0,04 было получено из измерений фоновой FRET версии датчика с мертвой киназой.

Мы выражаем признательность Институту Гладстона и Кену Накамуре, доктору медицины, за предоставленные плазмиды, использованные в этом исследовании, и благодарим Хироми Имамура, доктора философии, профессора Университета Киото, за создание оригинального биосенсора АТФ. (Имамура и др., 2009).

Braeckman, B.P., Houthoofd, K., De Vreese, A., Vanfleteren, J.R., 1999. Очевидное разъединение производства и потребления энергии у долгоживущих мутантов Clk Caenorhabditis elegans . Current Biology : CB 9, 493-496. Диллин, А., Хсу, А.Л., Арантес-Оливейра, Н., Лерер-Грейвер, Дж., Син, Х., Фрейзер, А.Г., Камат, Р.С., Аринджер, J., Kenyon, C., 2002. Скорость поведения и старения определяется функцией митохондрий во время развития. Science 298, 2398-2401. Имамура, Х., Нхат, К.П., Тогава, Х., Сайто, К., Иино, Р., Като-Ямада, Ю., Нагаи, Т., Нодзи, Х., 2009. Визуализация уровней АТФ внутри отдельных живых клеток с помощью генетически закодированных индикаторов на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии. PNAS USA 106, 15651-15656.Kamath, R.S., Ahringer, J., 2003. Полногеномный скрининг РНКи у Caenorhabditis elegans . Методы 30, 313-321.Мендельсон, Б.А., Беннетт, Н.К., Дарч, М.А., Ю, К., Нгуен, М.К., Пуччарелли, Д., Нельсон, М., Хорлбек, М.А., Гилберт, Л.А., Хюн, W., Kampmann, M., Nakamura, JL, Nakamura, K., 2018. Высокопроизводительный экран уровней АТФ в режиме реального времени в отдельных клетках выявляет механизмы сбоя энергии. PLoS Biology 16, e2004624.Nehrke, K., 2003. Снижение pHi кишечных клеток из-за потери обменника Na + / H + NHX-2 Caenorhabditis elegans увеличивает продолжительность жизни. Journal of Biological Chemistry 278, 44657-44666.Tsuyama, T., Kishikawa, J., Han, YW, Harada, Y., Tsubouchi, A., Noji, H., Kakizuka, A., Yokoyama, K. , Уэмура, Т., Имамура, Х., 2013. Визуализация флуоресцентного аденозин-5′-трифосфата (АТФ) in vivo у Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans с использованием генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора АТФ, оптимизированного для низких температур. Analytical Chemistry 85, 7889-7896.Wang, H., Webster, P., Chen, L., Fisher, AL, 2019. Автономные и неавтономные роли daf-16 в мышечной и митохондриальной функциях емкость в выдержке C. elegans . Старение 11, 2295-2311. Чжан, Дж., Хан, X., Лин, Ю., 2018. Анализ регуляции и функции АТФ на уровне отдельных клеток. PLoS Biology 16, e3000095.

Этот проект был поддержан грантом MARC U STAR для J.S., номер награды T34GM062756 от Национальных институтов здравоохранения.

Хосе Сото: курирование данных, визуализация, формальный анализ, расследование
Мадлен Ривера: расследование, визуализация
Джина Бройтман-Мадуро: визуализация, расследование, методология, надзор
Моррис Ф. Мадуро: методология, надзор, программное обеспечение, написание — первоначальный проект, Написание — просмотр и редактирование, концептуализация.

Аноним

Получено: 29 июня 2020 г.
Получено: 14 июля 2020 г.
Принято: 22 июля 2020 г.
Опубликовано: 30 июля 2020 г.

© 2020 Авторы.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Сото, Дж; Ривера, М; Бройтман-Мадуро, G; Мадуро, МФ (2020). Экспрессия АТФ-биосенсора на основе FRET в кишечнике C. elegans . микропубликация Биология. 10.17912 / micropub.biology.000284.
Загрузить: RIS BibTeX

Одномолекулярный FRET раскрывает механизм индуцированной подгонки селективности субстрата в эндонуклеазе лоскута 1

Существенные изменения:

— Между настоящей рукописью и одним из предыдущих отчетов авторов (Sobhy et al., Cell Reports 2013). Здесь FEN1 человека связывается примерно с 5 нМ Kd с различными субстратами ДНК, тогда как в предыдущей работе Kd был примерно в 50 раз выше. Кроме того, k-изгиб / связывание здесь ограничено диффузией, тогда как в предыдущей работе оно было на порядки меньше. Это несоответствие необходимо устранить.

Хорошее замечание. Нам неясно, почему K _d-bending был высоким в нашем предыдущем исследовании (Sobhy et al., Cell Reports 2013), но мы подозреваем, что это могло быть результатом неправильной подготовки системы поглощения кислорода.Здесь мы также оптимизировали очистку нативного FEN1 с помощью расщепляемого тега SUMO-fusion. Как отметили обозреватели, более медленная ассоциация и более высокая скорость диссоциации способствовали более высокому d-изгибу K . Тем не менее, значения FRET в несогнутом и изогнутом состояниях в схеме мечения лоскута, единственной схеме мечения, использованной Sobhy et al., И относительное сравнение изгибающихся родственных и непознанных субстратов остаются действительными результатами, подтвержденными текущим исследованием при оптимальных условиях. К _{Г-образный}.В исправленную рукопись мы добавили следующий абзац для решения этого вопроса.

«Неясно, что вызвало гораздо более высокий d-изгиб K , о котором сообщалось в нашей более ранней работе (Sobhy et al., 2013), но мы предполагаем, что влияли как более медленная ассоциация, так и более высокая скорость диссоциации. Тем не менее, состояния FRET одного NonEQ DF-6,1Flap и при изгибе посредством FEN1 и относительное сравнение изгиба родственного субстрата с нераспознанными субстратами аналогичны в условиях низкого и высокого K _{d-изгиба}, как показано ниже.”

— В этом направлении авторы заявляют в предыдущей работе, что «мы находим многоступенчатый механизм, который проверяет все особенности субстрата перед тем, как вызвать этап изгиба промежуточной ДНК, который, как считается, объединяет механизмы 5′-нуклеазы. Это достигается путем координации продевание 5′-створки зазубрины в консервативный шлюз с конической спиралью, наблюдение за активным сайтом и изгиб путем связывания в основании соединения ». Эти утверждения, если они верны, несомненно, украдут гром из текущей рукописи; однако, поскольку здесь не обсуждаются предыдущие результаты, неясно, решили ли авторы проигнорировать свое ранее опубликованное исследование, потому что оно было выполнено неправильно.Этот вопрос требует решения. Кроме того, авторы должны процитировать соответствующее исследование FRET одной молекулы FEN1, проведенное лабораторией Пенедо, опубликованное в Nucleic Acids Research 2014.

Спасибо, что отметили эти моменты. Мы приносим свои извинения за слишком краткое объяснение, связывающее текущие результаты с выводами Собхи и др. Теперь этот вопрос рассматривается в исправленной рукописи, как мы надеемся, подходящей подробностью.

Sobhy et al. использовали схему мечения лоскута, чтобы рассмотреть взаимосвязь между прохождением 5’-лоскута в капспиральный шлюз и изгибом ДНК.Эта схема маркировки показала, что блокирование заправки 5’-створки путем введения биотин / стрептавидиновой составляющей на 5’-створке привело к незначительному изменению FRET по сравнению с тем, когда нарезание резьбы было разрешено. Действительно, этот эксперимент можно воспроизвести при оптимальном d-изгибе K _{(данные не показаны). Собхи и др. поэтому предположили, что нарезание 5’-лепестков строго необходимо для индукции изгиба ДНК и, следовательно, изгиб ДНК происходит в конце распознавания субстрата; абзац, выделенный рецензентами.В текущем исследовании мы полагались на схему внутренней маркировки, которая напрямую сообщает о геометрии дуплексной ДНК. Эта схема маркировки привела к другому результату, показав значительное искажение дуплексной ДНК, когда процесс заправки 5’-лепестков был заблокирован. Однако это искажение было все же меньше, чем наблюдаемое при разрешении заправки 5’-створок. Мы также обнаружили, что изменение остатков в шлюзе снижает скорость изгиба ДНК. Хотя эти новые результаты также предполагают, что для правильного искажения ДНК требуется нарезка 5’-лоскута, как первоначально было предложено Sobhy et al., значительное изгибание ДНК, о котором сообщалось в текущем исследовании, затруднило окончательное исключение возможности того, что FEN1 может пронизывать 5’-лоскут после того, как он значительно изгибает ДНК или когда он изгибает ДНК. Эти результаты расширяют наши знания о взаимосвязи между заправкой 5’-лепестков и изгибом ДНК, но они также подчеркивают сложность понимания точного временного механизма заправки 5’-лепестков по сравнению с изгибом ДНК. В текущем исследовании мы также выполнили кинетический анализ включений и отклонений на несвязанных субстратах, в сочетании с измерениями FRET с высоким временным разрешением, и показали, что FEN1 способен сгибать как родственные, так и чужие субстраты, но демонстрирует замечательную селективность для стабилизации. изогнутый конформер родственного субстрата.Эти результаты вместе со значительным искажением ДНК при блокировании образования нитей 5’-лоскута более согласуются с моделью, согласно которой FEN1 изгибает ДНК и использует ее для исследования свойств субстрата. В отредактированную рукопись мы добавили обсуждение, связывающее результаты распознавания 5’-лоскута из схемы мечения лоскута в Sobhy et al. со схемой внутренней маркировки в текущем исследовании. Мы также добавили следующий заключительный параграф, в котором комментируются предложенные модели в обоих исследованиях.}

«В совокупности эти результаты демонстрируют, что FEN1 изгибает как родственные, так и непознаваемые субстраты, и что K _d-изгиб выше для непознаваемых субстратов. Это согласуется с нашими предыдущими выводами в условиях высокого значения d-изгиба K _{(Sobhy et al., 2013). Кроме того, они показали, что FEN1 стабилизирует родственный субстрат за счет замечательной селективности в отношении его ключевых характеристик полностью парных узловых соединений, 3’-створок и 5’-створок, при этом способствуя диссоциации нераспознанных субстратов.Наше наблюдение способности FEN1 значительно изгибать ДНК в комплексе с блокированной нитью ставит под сомнение наш предыдущий вывод о том, что нарезание 5’-лоскута строго необходимо для индукции изгиба ДНК (Sobhy et al., 2013). Наши новые результаты согласуются с моделью, в которой FEN1 активно изгибает ДНК, чтобы взаимодействовать с соединениями ss / ds-ДНК, а затем проверяет эти взаимодействия с помощью упорядочения белков, индуцированного 3’-лоскутом ».}

Рецензенты надлежащим образом попросили нас сослаться на работу Cragg et al.(НАР 2014). Это исследование показало, что подложка с двойным лоскутом чередуется между изогнутым и разогнутым состояниями. Мы полагаем, что использование схемы маркировки лоскутов является причиной, по которой Cragg et al. предположил, что подложка с двойным клапаном представляет собой динамическую структуру. Мы обнаружили, что эта динамическая природа является результатом локального изменения геометрии 5’-створки, а не изменения конформации дуплексной ДНК, когда длина 5’-створки превышает 6 нуклеотидов.

Репродукция Cragg et al. Эксперименты и их обсуждение представлены на Рисунке 1 — в приложении 2B к исходной рукописи.В исправленную рукопись мы добавили следующее утверждение в основной текст для решения этого вопроса.

«Схема мечения лоскута была чувствительна к изменению концентрации ионов Mg ²⁺, когда длина 5’-лоскута превышала 6 нт (Рисунок 1 — приложение к рисунку 2B). Это могло бы объяснить, почему предыдущая работа предполагала, что двухстворчатый субстрат представляет собой динамическую структуру (Craggs et al., 2014) ».

— Многие из критических аргументов в рукописи основаны на способности авторов очень точно построить распределение времени, прошедшего между сгибанием и разрезанием.Из описания в рукописи не ясно, как именно это делается экспериментально. Авторам необходимо уточнить, как они определяют точный момент изгиба и исключают ли они определенные молекулы на основе свойств в их следах FRET.

Мы ценим экспертную информацию рецензента по этим вопросам. В отредактированной рукописи мы даем более подробное описание назначения событий расщепления и их анализа в разделе «Методы». Мы также предоставляем дополнительный подробный анализ всех частиц во всем поле зрения как для родственных, так и для не родственных субстратов в новом дополнительном рисунке 2 — рисунке 2A, B, E.Эти анализы теперь количественно демонстрируют нашу способность приписывать событие расщепления 5’-створок.

— Утверждается, что доля событий связывания / изгиба, которые приводят к расщеплению, составляет 100%. Пожалуйста, предоставьте подтверждающие данные / статистические данные, подтверждающие это утверждение.

Мы не собирались подавать такое заявление и сожалеем об этом недоразумении. Мы имели в виду, что в случае родственного субстрата все эффективные частицы, которые, как считается, были расщеплены на основании критериев, подробно описанных в разделе «Методы» в измененной рукописи и показанных на новом дополнительном рисунке 2 — приложение к рисунку 2A, расщеплены. на первом этапе гибки.Мы надеемся, что новый дополнительный рисунок 2 — рисунок 2A и подробное описание анализа данных в разделе «Методы» устранят эту путаницу с нашей стороны в пересмотренной рукописи.

— На рис. 2 и 5 авторы анализируют время задержки между уменьшением FRET (изгиб) и исчезновением донорского сигнала (разрезание лоскута). Как они узнают, что исчезновение донорского сигнала не вызвано обесцвечиванием донора? Авторы должны предоставить экспериментальные доказательства, чтобы исключить этот сценарий.

Спасибо, что подчеркнули эту мысль. В отредактированной рукописи мы выполнили подробный анализ контрольных экспериментов, сравнивающих потерю Cy3 в условиях, когда FEN1 изгибает родственную ДНК, не расщепляя ее (ионы Ca ²⁺), или изгибает ее и расщепляет (ионы Mg ²⁺). показать, что потеря сигнала Cy3 происходит из-за расщепления; новый дополнительный рисунок 2 — приложение к рисунку 2A. Потеря сигнала Cy3 под Ca ²⁺ составляла ~ 20%, в то время как потеря сигнала под Mg ²⁺ составляла ~ 80%.Аналогичные результаты были получены для не родственного субстрата, как показано на новом дополнительном рисунке 2 — рисунок в приложении 2E.

Мы дополнительно проанализировали зависящую от времени потерю сигнала Cy3 в родственном субстрате в присутствии Ca ²⁺ или Mg ²⁺, как показано на новом дополнительном рисунке 2 — приложении к рисунку 2B. В присутствии Ca ²⁺ количество потерянных Cy3 было медленным и насыщалось около 20%.

В то время как в случае Mg ²⁺ наблюдается резкое изменение скорости потери сигнала примерно на 6 с, что совпадает с поступлением FEN1 в проточную ячейку.

Взятые вместе, эти анализы показывают, что потеря сигнала Cy3 в основном наблюдается из-за расщепления, а не фотообесцвечивания.

— Для неоптимальных субстратов расщепление и высвобождение продукта все еще наблюдается, но только после многих циклов непродуктивных событий связывания / изгиба. Авторы трактуют последнее событие привязки иначе, чем предыдущие события привязки, но почему? С большой вероятностью каждое событие связывания может приводить к расщеплению, но с меньшей скоростью, чем в случае оптимальных субстратов.Как исключить такую возможность? Если можно показать, что распределение времени пребывания для последнего события связывания количественно отличается от распределений времени пребывания более ранних событий связывания, возможно, текущая интерпретация может быть одобрена. В противном случае интерпретация последнего абзаца в подразделе «FEN1 предотвращает расщепление ДНК вне мишени на этапе блокировки ДНК» является подозрительной.

Время жизни изогнутого конформера в несвойственных субстратах было определено в присутствии Ca ²⁺ и показано на рисунке 4.Действительно, эти времена жизни значительно отличались от тех, которые наблюдались для последней стадии изгиба перед расщеплением в присутствии Mg ²⁺, либо больше, либо меньше. Это различие послужило основой для нашей интерпретации того, как FEN1 избегает расщепления неродственных субстратов.

Вкратце, взаимосвязь между временем жизни изогнутого конформера в присутствии Ca ²⁺ и временем пребывания в последнем изогнутом состоянии перед расщеплением в присутствии Mg2 можно разделить на две категории.В одной группе время жизни ограничивало скорость и, следовательно, не поддерживало время, необходимое для катализа. Во втором — в 3-4 раза больше времени, необходимого для катализа. Если каждое прерванное событие изгиба представляет собой этап, на котором катализ протекает медленнее, тогда ожидалось бы, что время задержки в последнем событии изгиба ДНК, которое привело к расщеплению, будет больше в обеих категориях, чем родственный субстрат, особенно во второй категории, где время жизни изогнутого конформера значительно больше, чем требуется для катализа.Мы наблюдали, что время задержки перед расщеплением отличалось от показанного на рисунке 4, и было количественно сходным как для родственных, так и для неконференционных субстратов. Сценарий, в котором катализ протекает с более медленной скоростью, показан в случае мутанта по активному сайту FEN1-Y40A, где время задержки перед расщеплением было в 3 раза больше, чем у родственных и не родственных субстратов.

— На рисунке 2 авторы показывают распределение времени, прошедшего между сгибанием и резкой, по возрастанию и убыванию.Утверждается, что это распределение вызвано наличием нескольких стадий, ограничивающих скорость, включая переход беспорядок-порядок и химию расщепления. Важным свойством распределений нарастания и спада является то, что они возникают только в том случае, если лежащие в основе ступени примерно одинаково ограничивают скорость. В последующем элегантном эксперименте авторы замедляют переход беспорядок-порядок в 3-4 раза (рис. 2D). Этот результат обеспечивает надежный прогноз; а именно, что распределение нарастания и спада теперь должно коллапсировать до распределения, которое полностью определяется переходом беспорядок-порядок как ступенькой, ограничивающей скорость.Однако, если посмотреть на рис. 2 — дополнение к рисункам 1B и C, можно увидеть распределение нарастания и спада с еще большим количеством шагов, ограничивающих скорость. Это разъединение необходимо устранить.

Здесь мы проясняем нашу логику. Если мы предположим, что распределение времени задержки должно отражать ограничивающий скорость этап конформационных изменений, вызванных 3’-лоскутом, все еще возможно, что лежащее в основе распределение конформационных изменений при добавлении вискогена само по себе может стать более сложным распределением.Это можно понять из простой модели диффузии, в которой скорость сворачивания обратно пропорциональна вязкости раствора. Предполагая, что без вискогена конформационные изменения были распределены экспоненциально, можно утверждать, что при добавлении вискогена конформационные изменения предполагали бы многоэкспоненциальное поведение из-за разной степени трения, создаваемого вискогеном для разных остатков в белке и, таким образом, показывая очевидные многоэкспоненциальные ступени во временах выдержки при расщеплении.Фактически, если мы построим график стандартного отклонения времени выдержки в зависимости от вязкости, мы обнаружим почти линейную зависимость (новый дополнительный рисунок 2 — рисунок в приложении 1E), как можно было бы спрогнозировать с помощью простой диффузионной модели. Проще говоря, это может означать, что при добавлении вискогена энергетические границы сворачивания становятся больше, в результате чего распределение индивидуальных скоростей сворачивания белков показывает большее стандартное распределение между собой. В отредактированной рукописи мы обсудили распределение времени выдержки нарастания и спада в присутствии вискогена следующим образом:

«Форма гистограмм в присутствии вискогена, однако, остается нарастающей и затухающей (Рисунок 2 — рисунок в приложении 1B), что позволяет предположить, что упорядочение белков, индуцированное 3′-створками, вероятно, будет включать многоступенчатые процессы, которые замедляются присутствием вискогена.Фактически, стандартное отклонение kSTO было почти линейно пропорционально вязкости, что можно было бы предсказать с помощью простой диффузии, когда разные участки белка испытывают разное трение при увеличении концентрации вискогена (рис. 2 — приложение к рисунку 1E) ».

— Аргумент в пользу взаимного индуцированного соответствия очень умозрительный. Конформационные изменения белков не измеряются напрямую, и любые предполагаемые конформационные изменения, по-видимому, не подтверждаются данными. Настоятельно рекомендуется удалить эти претензии.

Мы ценим эту продуманную рекомендацию. В отредактированной рукописи мы пересмотрели наши аргументы о взаимной индуцированной подгонке и использовали вместо нее только индуцированную подгонку. Мы согласны с рецензентом в том, что мы нечувствительны к конформационным изменениям белков. Однако мы чувствительны к вытягиванию 3 ’лоскута длиной 1 нт, что, как было установлено в предыдущих структурных исследованиях, вызывает конформационные изменения в белке. В отредактированной рукописи мы также прояснили, почему мы думаем, что индуцированные отношения между FEN1 и ДНК имеют взаимную природу, опираясь на аргумент, что 3’-створка активно отводится после изгиба ДНК.

— Выводы, сделанные на основе данных на Рисунке 3, основаны на способности авторов надежно различать довольно похожие уровни FRET. Описывается, как для этого анализировались конфокальные данные FRET, но на самом деле данные не показаны. Учитывая высокий уровень уверенности, необходимый для веры в точность значений FRET, очень важно, чтобы авторы показали эти данные, наблюдаемую вариацию в наборах из трех экспериментальных повторов и подгонку данных.

Это ключевой момент, который мы рады улучшить.Мы добавили новый дополнительный рисунок, чтобы показать все гистограммы, относящиеся к рисунку на новом дополнительном рисунке 3 — рисунок в приложении 1. Фактически мы повторили все эксперименты, представленные на рисунке 3, чтобы добавить еще один контрольный эксперимент, показывающий отсутствие эффекта от FEN1 на дцДНК. Это привело к незначительным изменениям всех исходных показаний FRET из-за небольших различий в условиях настройки лазерного луча конфокального микроскопа. Как видно на новом Рисунке 3, показания чрезвычайно согласуются между собой и с показаниями на первоначально представленном Рисунке 3 и имеют очень низкое стандартное отклонение.

[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]

Рукопись была улучшена, но некоторые из комментариев, похоже, были неправильно поняты, и в результате их ответная редакция не дала адекватных ответов на вопросы. Эти несколько оставшихся проблем (изложенных ниже) необходимо решить до принятия:

1) «Для неоптимальных субстратов расщепление и высвобождение продукта все еще наблюдается, но после многих циклов непродуктивных событий связывания / изгиба.Авторы трактуют последнее событие привязки иначе, чем предыдущие события привязки, но почему? Сильная вероятность состоит в том, что каждое событие связывания может приводить к расщеплению, но с меньшей скоростью, чем в случае оптических субстратов. Как они исключают такую возможность? Если они смогут показать, что распределение времени пребывания последнего связывающего события количественно отличается от распределения времени пребывания более ранних событий связывания, возможно, их текущая интерпретация может быть одобрена ».

В ответ на этот комментарий авторы сравнили время жизни связанного состояния в присутствии кальция со временем жизни конечного связанного состояния до расщепления.Однако такое сравнение не решает проблему, потому что нельзя исключить возможность того, что наличие кальция вместо магния может изменить кинетику на неоптимальных субстратах. Поскольку неоптимальные субстраты показывают несколько событий связывания (1, 2, …, n-1) до того, как n-е событие связывания приведет к расщеплению, они должны построить гистограмму времени пребывания предшествующих событий связывания и сравнить его со временем пребывания. гистограмма финального события. Этот вывод будет поддержан только в том случае, если они будут существенно отличаться друг от друга.

Мы ценим проницательность наших рецензентов. Мы сравнили время пребывания пропущенных событий в присутствии Mg ²⁺ во всех непознанных субстратах, а также мутантов FEN1 Y40A и R47A и обнаружили, что они аналогичны данным Ca ²⁺. Эти новые данные представлены на новой панели на рисунке 5 — рисунок в приложении 1 (панель F). Таким образом, первоначальный вывод остается в силе, поскольку время пребывания одинаково для Mg ²⁺ и Ca ²⁺.

2) «- На рисунке 2 авторы показывают распределение времени, прошедшего между сгибанием и резкой, по возрастанию и убыванию.Утверждается, что это распределение вызвано наличием нескольких стадий, ограничивающих скорость, включая переход беспорядок-порядок и химию расщепления. Важным свойством распределений нарастания и спада является то, что они возникают только в том случае, если лежащие в основе ступени примерно одинаково ограничивают скорость. В последующем элегантном эксперименте авторы замедляют переход беспорядок-порядок в 3-4 раза (рис. 2D). Этот результат обеспечивает надежный прогноз; а именно, что распределение нарастания и спада теперь должно коллапсировать до распределения, которое полностью определяется переходом беспорядок-порядок как ступенькой, ограничивающей скорость.Однако, если посмотреть на рис. 2 — дополнение к рисункам 1B и C, можно увидеть распределение нарастания и спада с еще большим количеством шагов, ограничивающих скорость. Это отключение необходимо устранить «.

Опять же, авторы, кажется, неправильно поняли комментарий. По крайней мере, одно из утверждений в оригинальной рукописи неверно, но какое из них не установлено.

Приносим извинения за недоразумение. Мы согласны с авторами обзора в том, что профиль нарастания и спада времени пребывания предполагает наличие нескольких ступеней с аналогичными константами скорости, происходящих в течение времени пребывания.Как отметили обозреватели, когда константа скорости одного из этапов (например, конформационного изменения) уменьшается, а другие остаются постоянными, этот этап действует как этап ограничения скорости, и гистограмма должна демонстрировать одноэкспоненциальный профиль затухания. Когда этот шаг замедляется, среднее время пребывания должно увеличиваться, и это действительно то, что мы наблюдали экспериментально на рисунке 2B. Стандартные отклонения в отсутствие или в присутствии различных концентраций глицерина находились в диапазоне 60-70% от их среднего значения, предполагая, что форма гистограмм аналогична и что количество этапов ограничения скорости не увеличивалось в присутствии вискогена.Это сходство в приближениях нарастания и спада можно увидеть визуально, если мы объединим наши данные в соответствии с некоторым оптимальным правилом объединения, таким как правило Скотта. Однако мы решили представить их с экспериментальным временным разрешением, поскольку оно максимально близко отражает необработанные данные.

Таким образом, рецензенты правы в том, что все еще существует несколько стадий, ограничивающих скорость, которые способствуют реакции расщепления. Одна из возможностей состоит в том, что в этой реакции есть несколько отдельных стадий конформационных изменений, которые замедлятся при увеличении вязкости раствора.Это включает в себя индуцированное 3’-лоскутом упорядочение белков, которое само по себе может быть многоступенчатым, и потенциально последующие конформационные изменения, необходимые для разрыва пары ДНК и ее перемещения в активный сайт. Если это так, все шаги будут замедляться, когда вязкость раствора увеличивается, и, следовательно, общая скорость реакции будет уменьшаться, в то время как форма нарастания и спада гистограммы останется прежней. Поэтому мы считаем, что утверждение в оригинальной рукописи о том, что упорядочение белков, вызванное 3’-лоскутом, является вероятным этапом, ограничивающим скорость, неверно.В отредактированной рукописи мы исправили это утверждение, а также прокомментировали форму гистограмм, как указано рецензентами. Теперь абзац гласит следующее: «Форма гистограмм в присутствии вискогена, однако, остается нарастающей и спадающей (Рисунок 2 — рисунок в приложении 1B), в отличие от предсказания коллапса в единичный экспоненциальный спад, если упорядочение белков будет действовать. за один ограничивающий шаг. Это предполагает, что упорядочение белков, индуцированное 3′-лоскутом, вероятно, включает многоступенчатые процессы, которые замедляются присутствием вискогена, и / или эти многоступенчатые действия контролируют различные этапы, ограничивающие скорость во время катализа, такие как разрушение пар ДНК и / или перемещение ДНК в активный центр. .”

3) «- Анализ данных, по-видимому, предполагает, что продуктивное высвобождение происходит мгновенно, потому что время ожидания между начальным изгибом и исчезновением флуоресценции интерпретируется как время реакции. Пожалуйста, предоставьте обоснование для этого предположения».

По сути, это не ответ, поскольку исчезновение лоскута оцДНК определяется как расщепление («лоскут оцДНК не взаимодействует с FEN1, исчезновение которого в нашем анализе определяется как расщепление»).Конечно, при таком определении выпуск продукта происходит одновременно с расщеплением. Однако расщепление действительно должно относиться к химической реакции расщепления остова; нет никаких априорных оснований полагать, что продукт расщепления должен высвобождаться мгновенно. Этот вопрос все еще требует решения.

Наше определение расщепления и общепринятое, используемое в литературе, состоит в том, что с момента, когда FEN1 связывает ДНК, комплекс претерпевает все необходимые конформационные изменения, происходит разрез и 5’-лепесток отходит от комплекса.Мы предоставили доказательства, подтверждаемые предыдущей литературой, что выпуск 5’-створок не является ограничивающим шагом, но, конечно, не означает, что он не способствует увеличению времени выдержки, которое мы называем единичным оборотом. Однако самым убедительным доказательством нашего предположения о том, что большая часть времени пребывания перед расщеплением соответствует катализу, а не высвобождению 5′-створок, является то, что наш единичный оборот аналогичен таковым из анализов объемного расщепления, которые не чувствительны к высвобождению 5′-створок в случае родственный субстрат.Чтобы устранить любую потенциальную путаницу в определении единичного оборота, мы добавили в нашу исправленную рукопись следующее утверждение: «Однако, поскольку выпуск 5′-створки по-прежнему будет вносить вклад в время выдержки перед расщеплением, наш единичный оборот следует рассматривать как очевидную ценность. . »

4) Что касается наблюдения, что после добавления вискогена, распределение времени выдержки остается нарастанием и спадом (что подразумевает, что продолжают существовать несколько этапов, ограничивающих скорость), утверждается, что присутствие визогена само по себе приведет к увеличению сложный ландшафт свободной энергии, который приведет к дополнительным шагам, ограничивающим скорость.Хотя это в принципе возможно, неясно, обязательно ли ширина распределения времени пребывания вызвана диффузией. Это утверждение следует уточнить или опустить.

Мы исключили это утверждение из исправленной рукописи, как это предлагается, а также связанную с ним панель рисунков для ясности.

https://doi.org/10.7554/eLife.21884.021

Активность ГТФаз семейства Rho во время деления клеток, визуализированная с помощью зондов на основе FRET | Журнал клеточной биологии

кДНК RBD эффекторных белков, включая mDia1 человека (aa 1–176), Rhotekin мыши (aa 1–88), Rhophilin мыши (aa 37–107), PKN человека (aa 13–98) и кДНК белка. Rac1 / Cdc42-связывающий домен PAK (а.о. 68–150) амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами, несущими сайты узнавания рестрикционного фермента на их 5′-конце, и субклонировали в pCR ^® -Blunt II-TOPO ^® (Invitrogen).Плазмиды для мониторов RhoA были сконструированы с использованием по существу той же процедуры, что использовалась для конструирования pRaichu-Ras (Mochizuki et al., 2001). От аминоконца Raichu – RhoA – 1202, –1208, –1125, –1126, –1206 и –1212 состояли из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Asp), дикого типа или мутантов человеческий RhoA (аминокислотные остатки 1–189), спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), RBD эффекторных белков, спейсер (Gly-Gly-Arg) и CFP (аминокислотные остатки 1–237). Raichu-1110X, -1111X, -1214X, -1220X, -1104X, -1105X, -1218X и -1224X состояли из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Asp), RBD эффекторных белков, a спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), человеческий RhoA (aa 1–189), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (aa 1–237), спейсер (Ser-Arg), и карбоксиконцевую область Ki-Ras4B (аминокислотные остатки 169–188).Raichu – RhoA – 1237X, –1238X и –1239X состояли из YFP (а.о. 1–228), спейсера (Leu-Asp), RBD PKN, спейсера (Thr-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly- Gly-Gly-Gly-Thr), RhoA дикого типа или мутанты RhoA человека (aa 1–189), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (aa 1–237), спейсер (Gly-Arg-Ser -Arg) и CAAX-бокс Ki-Ras4B (а.о. 169–188; рис. 1 A). В Raichu-RhoA / RhoA-CT карбоксиконцевая область RhoA (а.о. 173–193) была заменена на Ki-Ras4B в Raichu-RhoA-1237X.

Эффекторные белки, используемые в каждом зонде, перечислены в таблице I.В Raichu – RhoA – 1239X, Asn был заменен на Thr ¹⁹ RhoA. В других пробах RhoA был либо диким типом, либо мутантом Gln ⁶³ Leu (Q63L), как указано в таблице I. В этой статье, если не указано иное, мы использовали модифицированный YFP [Thr ⁶⁶ Gly, Val ⁶⁹ Leu, Ser ⁷³ Ala, Met ¹⁵⁴ Thr, Val ¹⁶⁴ Ala, Ser ¹⁷⁶ Gly и Thr ²⁰⁴ Tyr] и CFP [Lys ²⁷ Arg, Tyr ⁶⁷ Trp, Asp ¹³⁰ Gly, Asn ¹⁴⁷ Iso, Met ¹⁵⁴ Thr, Val ¹⁶⁴ Ala, Asn ¹⁶⁵ His, Ser ¹⁷⁶ Gly] в качестве акцептора и донора соответственно.Нуклеотидная последовательность кодирующих областей pRaichu-RhoA-1237X, которая использовалась в качестве Raichu-RhoA / K-Ras-CT в этом отчете, была депонирована в банке данных GenBank / EMBL / DDBJ (под номером доступа AB074297).

Raichu – 1502 / Raichu – RBD состоял из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Glu), RBD Rhotekin (aa 1–88), спейсера (Gly-Gly-Arg) и CFP ( аа 1–237). В Raichu – 1502 / Raichu – RBD мономерная Венера [Phe ⁴⁷ Leu, Thr ⁶⁶ Gly, Val ⁶⁹ Leu, Ser ⁷³ Ala, Met ¹⁵⁴ Thr, Val ¹⁶⁴ Ala, Ser ¹⁷⁶ Gly; и Thr ²⁰⁴ Tyr, Leu ²²² Lys, Phe ²²⁴ Arg] (Nagai et al., 2002; Zacharias et al., 2002) использовался в качестве YFP. В Raichu-Raichu-RBD-X карбоксиконцевая область RhoA была слита с Raichu-RBD.

План развития методов корреляционной микроскопии на 2018 г.

³ Ionovation GmbH, Оснабрюк, Германия

⁴ MRC Отделение иммунологии человека, Институт молекулярной медицины Weatherall, Оксфордский университет, Хедли-Уэй, OX3 9DS Оксфорд, Великобритания

⁵ Институт Фрэнсиса Крика, Лондон , Великобритания

⁶ INM — Институт новых материалов Лейбница, 66123 Саарбрюккен, Германия

⁷ Саарландский университет, 66123 Саарбрюккен, Германия

⁸ Dpto.Física de la Materia Condensada Universidad Autónoma de Madrid 28049, Мадрид, Испания

⁹ Instituto de la Materia Condensada IFIMAC, Автономный университет Мадрида 28049, Мадрид, Испания

¹⁰ KU Leuven, Департамент химии -3001 Хеверли, Бельгия

¹¹ Институт прикладной оптики, Университет Фридриха-Шиллера, Йена, Германия

¹² Институт фотонных технологий им. Лейбница (IPHT), Йена, Германия

¹³ Кафедра машиностроения, Университет Висконсин-Мэдисон, 1513 University Ave, Madison, WI 53706, Соединенные Штаты Америки

¹⁴ Институт ревматологии Кеннеди, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания

¹⁵ Институт Дебая, Утрехтский университет, Утрехт, Нидерланды

¹⁶ Департамент клеточной биологии, Университет Гронингена, Университетский медицинский центр Гронингена, Гронинген , Нидерланды

¹⁷ Отдел структурной биологии, Wellcome Trust Center for Human Genetics, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания

¹⁸ Центр структурной системной биологии Гамбург и Гамбургский университет, Гамбург, Германия

¹⁹ Институт Генриха Петте, Институт вирусологии Лейбница, Гамбург, Германия

²⁰ Физика визуализации, Технологический университет Делфта, Делфт, Нидерланды

²¹ Департамент биохимии, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания

²² Секция клеточной биологии, Центр молекулярной медицины, Университетский медицинский центр Утрехта, Утрехтский университет, Heidelberglaan 100, 3584CX Утрехт, Нидерланды

²³ Центр расширенной визуализации, Университет Квинсленда, Брисбен, QLD 4072, Австралия

²⁴ Университетская клиника Йены, Йена, Германия

²⁵ Факультет of Medicine, Саарландский университет, 66421 Хомбург, Германия

²⁶ Геттингенский университет, Третий физико-биофизический институт, 37077 Геттинген, Германия

²⁷ KU Leuven, Департамент инженерной биологии, B-3001 Heverlee, Бельгия

²⁸ Геттингенский университет, Институт рентгеновской физики, 37077 Геттинген, Германия

²⁹ SmarAct GmbH, Schütte-Lanz-Str.9, D-26135 Ольденбург, Германия

³⁰ Институт теоретической физики и BioQuant, Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия

³¹ Школа биохимии, Бристольский университет, Бристоль, Соединенное Королевство

³² Департамент Физиология, анатомия и генетика, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания

Подкаст «100 словесных историй» — рассказ из 100 слов каждый день до моей смерти.

Привет. Это Лоуренс Саймон из подкаста «100 словесных историй» от одного дня до последнего.com.

Каждую неделю я публикую тему для Weekly Challenge, где вы придумываете истории, а я собираю их и делюсь ими.

Хотите попробовать? Тема следующего еженедельного конкурса «100 словесных историй» — . Не нажимайте кнопку!

Напишите рассказ из 100 слов на эту тему. Затем отправьте его по электронной почте на адрес isfullofcrap (at) gmail.com, указав в строке темы ЕЖЕНЕДЕЛЬНЫЙ ВЫЗОВ.

Включите следующее:

Текст вашего рассказа.
Тема или темы для будущих еженедельных испытаний.
Веб-сайт, на котором люди могут больше узнать о вас и ваших произведениях, включая URL-адрес этого веб-сайта.
Запись вашей истории. Обязательно представьтесь публике.

Я собрал серию в воскресенье утром. Но, если вам нужно больше времени, я могу разместить вашу историю в ленте в отдельном посте.

https://oneadayuntilthedayidie.com/wp-content/uploads/2021/05/thenexttopicisDONTPRESSTHEBUTTON.mp3

Удачи и, как всегда… кратко.

3 ЯНВАРЯ Пожар
10 ЯНВАРЯ Почему мама плачет?
17 ЯНВАРЯ Получите жизнь!
24 ЯНВАРЯ Как это вас захватило?
31 ЯНВАРЯ крадущийся, каноник, все, до / слишком / два, риск, просроченный, спрей-загар

7 февраля Smalltalk
14 февраля Пицца
21 февраля вино
ВЕНТИЛЯТОР 28 Руины, Конус, тост !, Бунтарь, Погружение, Смена имени, Свечение

7 МАРТА Наклон
14 МАРТ За кустом
21 МАР Без ограничений
28 МАРТА Помните только это…, Объем, Церковь, Расплав, Выцветание, Голый

4 апреля Переход через реку
11 апреля Advanced
18 апреля Святой
25 апреля Дым, фасоль, Когда перестанет дождь, Вакцина, Карантин, Шлем, Олово

Список 2 МАЯ
9 МАЯ Оставайтесь в безопасности
16 МАЯ Не нажимайте кнопку!
23 МАЯ Рука
30 МАЯ Адрес, Блуждающий шут, Зайчик, Вид, Волшебник, Что это на горизонте?, Барк

ИЮН 6 Торговля
ИЮН 13 Верховая езда
ИЮН 20 Подсказка
ИЮН 27 Кристалл, медь, вспышка, сдержанный, тонкая бумага, бонус, отбеливатель

4 ИЮЛЯ Так много вопросов
11 ИЮЛ Игла
18 ИЮЛЯ Письмо
25 ИЮЛЯ Вы можете мне помочь?, Достаточно, Рынок, Пробная версия, Пакет, Шум сводит меня с ума !, Инвентарь

1 авг. Отбросить
8 авг. Неправильное обозначение
15 авг. Если бы я получал никель за каждый раз
22 авг. С чего мне начать?
29 августа Полный, Куда они делись?, Бочка, Ваш звонок, Универсально, Совместное, Кто-то может сказать…

5 СЕН. Сомнительно
СЕН 12 Перед вами…
СЕН 19 Пекло момента
26 СЕН Ремесло, Торжественно, Пустые места, Щелчок, Протокол утилизации, Вы спасли мою жизнь, Уровень

3 октября Выпивка
10 октября После
17 октября Распад
24 октября… С начала записи
31 октября Vase, Rub, Top, Spring fresh, Chime, The End, Crop

7 ноября Не уверен
14 ноября Поджог
21 ноября Что это у тебя на лице?
28 НОЯБРЯ Квадрат, Неожиданное сообщение, Построение, Дверь распахнулась, Лад, Предсказание, Медуза

DEC 5 Bee
DEC 12 Store
DEC 19 Левый
DEC 26 Не толкай меня…, Анимация, Сострадание, Безразличие, Союзник, Кит, Разветвление дороги

НАСТОЯЩИЕ ТЕМЫ

Передержанный
Даже
Выберите один
Тушите огонь огнем
Липучка
Опечатка
Уоррен
Тонкий шпон
Возраст
Полоса
Я был очень молод
Смесь для брауни
Клише
Слабый
Бескомпромиссный
Все еще цветет 9089?
Поздно
Я буду там
Волосы
Скользкий склон
Слишком много, чтобы выдержать
Погода
Лак
Объяснение
Профилактическое обслуживание
Контакт
Приземление
Крем для мышей
Бесплатно
Мыши
Жевательный
Годзилла
Сладкий запах успеха
Приговор
Доверие
Twist
Чаща
Каждое доброе намерение
Поезд
Призрак
Тысячи лет
Виртуальная реальность
Подсказка
Чрезвычайно гибкий
Консенсус
Major
Табло
Где угодно
Блокировщик пула
Major
Koakala
Гаджет
Робот
Дроссель
Кросс-кантри
Поп
Где Этель?
Зубная паста
Concertina
Pacing
Screaming Kids
Галстук
Сделка
Архимед
Доказательства
Пытка водой
Собственная
Кассетная лента
Помните
Самый удаленный
Все
Мимы
Что такое удаленное
9089 Контактные линзы
Clemencyh 9089 следующий?
Выйти
Remastered
Heated
Record
Как мы были
Миллионы
Стрелка
Январь
Код
Offroad
Мышеловка
База
Факты
Марсианин
Штамп
Водонепроницаемый
Неправильные слова
Безопасная бездонная яма 9089 неизвестный язык.
Неотразимый
Анахайм
Скорость
Положи эту штуку
Шпионская камера
Пью
Доказательства
Март
Ужас в метро!
Толстый
Открытый
Ваша честь
Диета
Точка
Супергерой
Ведущий
Свиток
Стиль
Диапазон
Вместе
Блок
Трещина на тротуаре
Шенанеганс
Ослепленный
Насколько хватит глаз1
Захват
Удовлетворен 9089 Коллекция вовремя
Восстановление
Влага
Стенд
Каньон
Revewal
Старые видео
Буйство цветов
Раскол
Картофельные глазки
Фотография
Это грязная работа
Штраф
Накладные расходы
Почему я должен?
Mass
Горчично-желтый
Basic
Opportunity
Afford
Blue sky
Part
Рагу из крыс
Очки
Деталь
Украденный
Хлеб
Узнаваемость бренда
Контактные линзы
Прицепы
Съеденные львами
Лев, который ел вишню
полагаю
Вклад
Сокращение экипажа
Дилеры
Грязный
Лот
Случайный