22Фев

Лампы в дхо лада гранта: Ошибка 404. Страница не найдена — Объявления на сайте Авито

Содержание

Лампы ДХО Лада Гранта: замена, какие лучше

Лампа ходовых огней появилась в арсенале современных автомобилей сравнительно недавно. В техническом руководстве отечественной модели Лада Гранта четко обозначено, что роль дневных ходовых огней (ДХО) возложена на габаритную оптику, конструкция которой является двух-нитевой. Во время включения зажигания сначала загорается нить, отвечающая за работу ДХО, а с активацией фар происходит одновременное включение габаритного освещения. Мощность первой из обозначенных нитей составляет 21 Вт, а второй – 5 Вт.

Для ходового освещения производитель применяет обыкновенные лампы ДХО. Самым неоспоримым преимуществом таких приборов является их низкая стоимость, а вот «минусов» более, чем достаточно. Об этом свидетельствуют рекламации покупателей, где отражено недовольство тусклым световым пучком желтоватого оттенка и низким показателем ресурса осветительного устройства. Многих владельцев машины интересует вопрос: как поменять лампочку ходовых огней.

Такая расстановка фактов заставляет владельцев Лада Гранта «бросаться» на поиски аналогов ДХО и заменять при первой возникшей возможности. В роли таковых приборов подойдут светодиодные лампы ДХО без цоколей или обычные устройства, но с повышенной светоотдачей и более приятным цветовым спектром излучения. В ассортименте любого специализированного магазина таких ламп предостаточно. Если владельцу по душе светодиодная техника, то специалисты советуют брать к учету параметр их яркости. Что делать, когда необходима замена лампы ходовых огней.

О лампах с повышенным визуальным комфортом

Для Лада Гранта такая лампа ходовых огней являюется обычными осветительными приборами, выполненными по стандартной галогенной технологии, но имеющие более приятный белый световой спектр. В виде главного их недостатка фигурирует снижение видимости при дождливой погоде. Это объясняется склонностью белого света давать больше бликов от намокших поверхностей и дождевых капель в сравнении с желтым оттенком.

Если конкретизировать данный момент, то в числе наиболее распространенных галогенных продуктов, которые охотно приобретаются многими владельцами, можно увидеть следующие:

  • «OSRAM» и «General Electric»;
  • «Маяк» и «Philips»;
  • «Narva», «IPF» и «Hella».

Это еще не весь рекомендованный перечень приборов. Если поинтересоваться приоритетами производителя авто, то ему симпатизируют «OSRAM h5». Эти устройства имеют два варианта исполнения:

  • «Standard»;
  • «Light Day».

Первая версия обладает полным соответствием регламентам законодательного характера в плане обеспечения безопасных условий применения, в числе которых: сила тока, светотеневая граница, освещенность, геометрия подачи пучка и мощность.

Второй вариант имеет выгодное отличие от первого в плане повышенного ресурса, однако уступает в мощности светового пучка. Однако, приобрести приборы это одно, необходимо знать, как поменять лампочку ходовых огней своими руками.

Если требуется замена ламп, то ее осуществляют следующим простым методом.

Отвечаем на вопрос, как поменять лампочку ходовых огней своими силами.

  1. Обеспечиваем комфортный доступ к осветительному устройству левой (по ходу) стороны. С этой целью извлекаем корпус фильтрующего компонента воздушного впускного тракта с отсоединением датчика, его подводящих кабелей и патрубков.
  2. Сам корпус подвергаем принудительному смещению вверх и налево.
  3. Для обеспечения доступа к фаре правого бока авто требуется снятие декоративной крышки мотора. Здесь временно откручиваем масло-заливную пробку, затем отвинчиваем 4 крепежных узла и тянем крышку (отщелкиваем).
  4. Извлечение отработавшей лампы ДХО предполагает предварительный поворот патрона против часовой стрелки, после чего его извлекаем из посадочного гнезда. Вынув старую лампу, монтируем новый элемент в патронный паз. Теперь закручиваем сам патрон в блок.

Внимание! Смена галогенных устройств не «терпит» касания пальцами к поверхности их колб.

Это связано с риском оставления отпечатков от потожировых выделений, что негативно сказывается на ресурсе прибора. Рекомендуем в работе пользоваться хлопчатобумажными перчатками, не имеющими резинового напыления на рабочих зонах. Перед монтажом ламп на LADA Granta их колбы протирайте спиртосодержащими салфетками. Именно так и происходит замена лампы ходовых огней.

Коврик в багажник Лада Гранта лифтбек

Сравнение Веста и Гранта сравнение

Диодные ходовые огни

Обозначенный процесс замены ламп на Лада Гранта не предполагает обладания владельцем сверх — способностей, однако сопряжен с некоторыми незначительными нюансами.

  1. Замена лампы ходовых огней на светодиодные аналоги предполагает свое выполнение одновременно в обеих фарах.
  2. При монтаже светодиодных устройств требуется обязательное соблюдение полярности их подключения.

Внимание! Если не учесть необходимость обеспечения полярности, то это приводит к мгновенному выходу из строя самого осветительного устройства. Кроме того, в зону риска попадает предохранитель, защищающий цепь ДХО.

К проверке полярности огней на LADA Granta следует привлекать тестер с включенным в нем режимом вольтметра. Перед извлечением отработанных ламп включаем ДХО. Когда контакты приемников получают напряжение, к их поверхности подносим щупы вольтметра (красный с черным). Смотрим на показания и, если обнаруживаем отрицательное значение, то это свидетельствует о нарушении порядка (полярности) подключения. Цифровой тестер в таком случае выводит на экран «минус», а аналоговый – «загоняет» стрелку ниже «нуля».

Особенности монтажа светодиодных ДХО

Если не удалось отыскать устройства для Лада Гранта без цоколей, то можно остановиться на применении обычных изделий. Здесь понадобится собственноручное удаление цоколя, а его освободившиеся контакты требуется подгонять под монтажные отверстия.

После завершения процедуры замененные приборы не следует выбрасывать. Это объясняется потребностью соблюдения регламента, регулирующего нормативно-технические требования к аспектам дневного освещения, что предполагает посещение тех-центра. Если этим пренебречь, то возможен риск запрещения эксплуатации автомобиля с доработанной таким образом светотехникой при очередном техосмотре.

Сегодня рыночная сеть способна предложить массу светодиодных устройств для LADA Granta, обладающих разным спектром освещения. Однако регламентные нормы говорят о допустимости только белого или желтого оттенка для ДХО, а остальные альтернативы запрещены.

Приборы на светодиодной технологии, в том числе и лампы ДХО отличаются от галогенных сравнительно меньшим потреблением энергии. Это позволит в дальнейшем снизить уровень нагрузки на АКБ. Забыв однажды деактивировать ДХО на ночь, вы все равно минимизируете риск разрядки аккумулятора.

Конструктивное устройство системы освещения Лада Гранта предполагает присутствие в схеме реле, несущего ответственность за обеспечение функционала ДХО. Кроме этого, данное устройство обеспечивает подачу питания к стоп-сигналам и инжектору. Ввиду сниженного энергопотребления светодиодных устройств на авто LADA Granta, реле способно генерировать некорректные показания, сетуя на неисправность ДХО. При такой картине лампа ходовых огней на «приборке» будет активироваться с надоедливой частотой, а встроенный диагностический комплекс издавать звуковые сигналы. Чтобы ликвидировать проблему, потребуется замена стандартной панели на экспортный аналог, устанавливаемый в европейские версии Лада Гранта. А как поменять лампочку ходовых огней мы описали выше.

Лада Гранта — лампы, применяемые в автомобиле — журнал За рулем

От исправности внешних световых приборов вашего автомобиля зависит безопасность - не только ваша и ваших пассажиров, но и других участников дорожного движения. Вот почему крайне важно знать, какие лампы предусмотрены производителем для установки в световых приборах вашей Лада Гранта, и уметь в случае необходимости их заменить.

Из соображений безопасности водителей, пассажиров и пешеходов Правилами дорожного движения и Техническим регламентом о безопасности колесных транспортных средств запрещена эксплуатация автомобилей, внешние световые приборы которых не соответствуют требованиям конструкции данного транспортного средства. Ведь, с одной стороны, необходимо, чтобы автомобиль был хорошо виден на дороге, а с другой — опасно ослепить других водителей или пешеходов слишком ярким или неправильно настроенным светом фар. Работающие стоп-сигналы позволят держать безопасную дистанцию двигающимся за вами водителям. Таких нюансов множество, и каждый может сберечь не только средства и нервы, но часто и здоровье.

===

Лампы, применяемые в автомобиле Лада Гранта

Лампы, применяемые в автомобиле Лада Гранта

Лампы, применяемые в автомобиле Лада Гранта

[14 операций по техобслуживанию Lada Granta, которые помогут вам сэкономить]

[Как сэкономить на плановом ТО Lada Granta] [Техническое обслуживание Lada Granta на 2,5 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 15 000 и 105 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 30 000 и 60 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 45 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta 75 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 90 тыс. км пробега] [Самостоятельное проведение ТО — общие рекомендации] [Правила техники безопасности при самостоятельном проведении ТО] [Инструмент, необходимый для проведения техобслуживания Lada Granta] 

Понравилась заметка? Подпишись и будешь всегда в курсе!

За рулем на Яндекс.Дзен

Lada Granta. Установка светодиодных дневных ходовых огней на Лада Гранта

АвтоВАЗ любит придумывать самые лучшие схемы и нестандартные решения. Вот в этот раз тоже самое.
Распиновка на стандартном цоколе - совершенно нестандартная. Поэтому если установить обыкновенную светодиодную led лампу, то возможны следующие варианты: либо не будет работать ходовой огонь (или габариты), либо начнет дымиться..

Вариантов решения этой задачи несколько.

Вариант 1.
Переделать разъем в автомобиле. Для этого необходимо разобрать разъем, распилить контакт, каким то образом закрепить контакты в цоколе и перепаять контакты. По моему бесперспективно, как все это будет держаться и как скоро все развалиться.

Вариант 2.

Переделать светодиодную лампочку. Разобрать цоколь и перевернуть, перепаять контакты. Вроде не сложно, при условии, что лампочку удастся разобрать и не сломать при обратной сборке.

Вариант 3.
Самый варварский. Высверлить полностью цоколь из штатного разъема Гранты. Вклеить туда лампочку намертво и провода уже или припаять так как нужно, или купить дополнительный разъем и на него припаять. 

Самый правильный Вариант - использование специальных Неполярных светодиодных Led ламп. Это означает, что каким бы образом не подавали "+" и "-", электроника внутри лампы сама определит, каким образом подавать питание на чипы.

Вот например эта лампа.

Оцените!
Световой поток - 720 Lm (галогеновая лампа ближнего света дает поток 1200 Lm)
Чипы - американского производства CREE, 6 шт
Мульти напряжение от 12 до 24 В
Неполярные
Заявленный срок службы более 30000 часов.

На фото указан предохранитель дневных ходовых огней на автомобиле Лада Гранта

.
При экспериментах и подборе светодиодных ламп - он часто сгорает.

Для сравнения.
В одной фаре автомобиля Лада Гранта установлена светодиодный ДХО, в другой - стандартная лампа.

 
А теперь как смотрится в темноте. Разница очевидна!

Светодиодный ходовой огонь и включенный ближний свет. 
Ну в общем, ближний - дальний свет тоже нужно менять на светодиодные лампы.
Например, на такие - LED CARS h5 HI/LO  3600 LM 

Несколько фотографий для обзора.

Если вы ищите где купить светодиодные ходовые огни на Ладу Гранта, то оформляйте заказ с бесплатной доставкой по Республике Башкортостан на нашем сайте www.Sabbas.ru
Если вы ищите где установить светодиодные ходовые огни , то приезжайте к нам в Установочную студию "SabbaS" по адресу: г. Уфа, ул. Коммунистическая, 116

 

Дхо гранта цоколь лампы

Лампа ДХО Лада Гранта — это осветительный прибор для дневных ходовых огней. В автомобилях этой марки функцию таких огней выполняют лампы габаритов. В технической литературе они так и называются: двухнитевые лампы габаритного и дневного ходового огня (ДХО). При включении зажигания загорается 21-ваттная нить ходовых огней, а при включении фар — 5-ваттная нить габаритов.

Изготовитель комплектует Ладу Гранта самыми простыми и недорогими лампами ДХО. Недостатков у них много, а преимущество только одно — низкая цена. Одними из главных покупательских рекламаций на эти лампы являются тусклый желтоватый свет и очень низкий ресурс при эксплуатации.

Автолюбители, не желающие мириться с недостатками стандартных дневных ходовых огней, заменяют их другими моделями при первой же возможности. В качестве источников света подходят светодиодные лампы без цокольной сборки или лампы повышенного визуального комфорта. Ассортимент таких ламп достаточно широк, найти их можно практически в любом магазине автозапчастей. При выборе источников светодиодного освещения специалисты рекомендуют руководствоваться параметром яркости.

Лампы повышенного визуального комфорта

Лампа ДХО Лада Гранта повышенной комфортности представляет собой обыкновенные галогенные лампы накаливания ближнего света, светящие белым. Основным недостатком является ухудшенная видимость в дождливую погоду из-за того, что белый свет дает намного больше бликов от мокрых поверхностей и капель дождя, чем желтый.

В продаже чаще встречаются следующие марки галогенных лам высокого комфорта: OSRAM, General Electric, Маяк, Philips, Narva, IPF, Hella и др. Производитель рекомендует выбирать модели OSRAM h5 в модификациях Standard и Light Day. Первая полностью соответствует всем нормам и требованиям законодательства по безопасности, освещенности, геометрии и точности светотеневой границы. Имеет самое высокое значение силы света. Вторая модель отличается от первой значительно более высоким сроком службы. По силе света немного уступает модификации Standard.

Замена ламп ближнего света осуществляется так. Освободите доступ к левой блок-фаре. Для этого освободите корпус воздушного фильтра Лады от всех креплений, отсоедините жгут проводов и датчик. Затем сдвиньте корпус фильтра вверх и влево. Чтобы получить доступ к правой блок-фаре, необходимо снять крышку силового агрегата. Для этого отвинтите крышку маслозаливной горловины, а затем 4 крепежных болта. После этого потяните крышку вверх и отщелкните ее.

Чтобы извлечь старую лампу, сначала поверните патрон против часовой стрелки, после чего аккуратно вытягивайте источник света. Новую устанавливайте в обратном порядке: сначала установите цоколь в паз патрона, затем закрутите патрон по часовой стрелке.

Обратите внимание: при замене галогенных ламп не рекомендуется касаться колб пальцами.

Дело в том, что потожировые следы от пальцев на колбах световых приборов многократно сокращают их ресурс. Поэтому работать необходимо в чистых хлопчатобумажных перчатках без напыления из резины. Сами колбы перед установкой протрите спиртовыми салфетками.

Дневные ходовые огни на основе диодов

Замена ламп накаливания и установка светодиодов на автомобиле Лада Гранта не требует особых навыков, но имеет некоторые нюансы. Во-первых, лампы в обеих фарах должны заменяться одновременно: если меняете одну лампу накаливания на светодиодную, то другую тоже обязательно смените. Во-вторых, замена ламп на светодиодные источники освещения требует обязательного соблюдения полярности питания.

Обратите внимание: при попытке установки светодиодной лампы без соблюдения полярности она мгновенно выходит из строя. Более того, существует высокая вероятность выхода из строя предохранителя питания ламп ДХО. Поэтому, если все же ваши действия привели к перегоранию прибора, перед новой попыткой обязательно меняйте предохранитель.

Полярность контактов определяется с помощью вольтметра (тестера). После того как старые лампы будут извлечены, необходимо включить дневные ходовые огни, чтобы на контакты подавалось напряжение. Затем красный щуп вольтметра подключаете к одному контакту, черный — к другому. Если прибор покажет положительное напряжение, то красный щуп будет соответствовать «плюсу», а черный — «минусу». Если вольтметр показывает отрицательное постоянное напряжение, значит, провода подключены наоборот: красный — к «минусу», черный — к «плюсу».

При этом цифровой тестер отрицательное напряжение будет выдавать со знаком «минус», а показания стрелочного вольтметра уйдут ниже нуля.

Нюансы установки светодиодных ламп ДХО

Если не нашлось бесцокольных светодиодных ламп для Лада Гранта, можно установить обыкновенные цокольные. При этом придется самостоятельно удалить цоколь с диода, а освободившиеся усики подогнать под установочные отверстия.

После окончания замены ламп не выкидывайте старые галогеновые приборы. Дело в том, что для соблюдения нормативно-технических требований к дневному свету после установки новых ламп нужно будет посетить техцентр. В противном случае очередной плановый техосмотр запретит эксплуатацию авто с такими доработанными фарами.

В продаже имеется множество светодиодных источников света различных цветов и оттенков. Но по нормам испускаемый дневными ходовыми огнями свет должен быть только белым или желтым. Все остальные цвета запрещены.

Светодиодные лампы потребляют значительно меньшее количество электроэнергии, чем стандартные лампы накаливания. Поэтому установка светодиодных огней существенно снизит нагрузку на аккумулятор. Если вы забудете выключить на ночь ходовые огни, к утру аккумулятор почти не разрядится.

Конструкцией автомобиля Лада Гранта предусмотрено реле, контролирующее исправность ДХО. Кроме того, это реле одновременно следит за функционированием инжектора и стоп-сигналов. Учитывая, что светодиодные лампы потребляют меньше энергии, реле контроля может давать ошибочные показания, сигнализируя о том, что ходовые огни неисправны. То есть лампа ДХО на приборной панели будет часто включаться, а бортовая диагностическая система постоянно пищать.

Чтобы избавиться от подобной проблемы, необходимо заменить стандартную приборную панель ее экспортным вариантом, предназначенным для европейских вариантов Лада Гранта.

Premium LED автолампы Kaizen с цоколем W21/5W, T20 7443, 7440, для дневных ходовых огней Лада Гранта. БЕЗ ПЕРЕДЕЛОК!

Osram, Philips, MTF Light и др. подобные бренды — держат передовые места на рынке автомобильных светодиодных ламп. Качество товара продаваемого под этими брендами — хорошее. Однако общеизвестно, что чем раскрученей бренд тем больше цена (за рекламу нужно платить).
Не секрет, что большая часть LED автоламп этих брендов производиться в Китае, поэтому я задался целью приобрести напрямую, без «посредников», светодиодные лампы премиум класса. Благодаря китайскому сайту АлиЭкспресс сделать это не составило труда.

Контрольными фразами для поиска стали: W21/5W, T20, 7443, 7440, SRCK.

Лампа ходовых огней появилась в арсенале современных автомобилей сравнительно недавно. В техническом руководстве отечественной модели Лада Гранта четко обозначено, что роль дневных ходовых огней (ДХО) возложена на габаритную оптику, конструкция которой является двух-нитевой. Во время включения зажигания сначала загорается нить, отвечающая за работу ДХО, а с активацией фар происходит одновременное включение габаритного освещения. Мощность первой из обозначенных нитей составляет 21 Вт, а второй – 5 Вт.

Для ходового освещения производитель применяет обыкновенные лампы ДХО. Самым неоспоримым преимуществом таких приборов является их низкая стоимость, а вот «минусов» более, чем достаточно. Об этом свидетельствуют рекламации покупателей, где отражено недовольство тусклым световым пучком желтоватого оттенка и низким показателем ресурса осветительного устройства. Многих владельцев машины интересует вопрос: как поменять лампочку ходовых огней.

Такая расстановка фактов заставляет владельцев Лада Гранта «бросаться» на поиски аналогов ДХО и заменять при первой возникшей возможности. В роли таковых приборов подойдут светодиодные лампы ДХО без цоколей или обычные устройства, но с повышенной светоотдачей и более приятным цветовым спектром излучения. В ассортименте любого специализированного магазина таких ламп предостаточно. Если владельцу по душе светодиодная техника, то специалисты советуют брать к учету параметр их яркости. Что делать, когда необходима замена лампы ходовых огней.

О лампах с повышенным визуальным комфортом

Для Лада Гранта такая лампа ходовых огней являюется обычными осветительными приборами, выполненными по стандартной галогенной технологии, но имеющие более приятный белый световой спектр. В виде главного их недостатка фигурирует снижение видимости при дождливой погоде. Это объясняется склонностью белого света давать больше бликов от намокших поверхностей и дождевых капель в сравнении с желтым оттенком.

Если конкретизировать данный момент, то в числе наиболее распространенных галогенных продуктов, которые охотно приобретаются многими владельцами, можно увидеть следующие:

  • «OSRAM» и «General Electric»;
  • «Маяк» и «Philips»;
  • «Narva», «IPF» и «Hella».

Это еще не весь рекомендованный перечень приборов. Если поинтересоваться приоритетами производителя авто, то ему симпатизируют «OSRAM h5». Эти устройства имеют два варианта исполнения:

Первая версия обладает полным соответствием регламентам законодательного характера в плане обеспечения безопасных условий применения, в числе которых: сила тока, светотеневая граница, освещенность, геометрия подачи пучка и мощность.

Второй вариант имеет выгодное отличие от первого в плане повышенного ресурса, однако уступает в мощности светового пучка. Однако, приобрести приборы это одно, необходимо знать, как поменять лампочку ходовых огней своими руками.

Если требуется замена ламп, то ее осуществляют следующим простым методом.

Отвечаем на вопрос, как поменять лампочку ходовых огней своими силами.

  1. Обеспечиваем комфортный доступ к осветительному устройству левой (по ходу) стороны. С этой целью извлекаем корпус фильтрующего компонента воздушного впускного тракта с отсоединением датчика, его подводящих кабелей и патрубков.
  2. Сам корпус подвергаем принудительному смещению вверх и налево.
  3. Для обеспечения доступа к фаре правого бока авто требуется снятие декоративной крышки мотора. Здесь временно откручиваем масло-заливную пробку, затем отвинчиваем 4 крепежных узла и тянем крышку (отщелкиваем).
  4. Извлечение отработавшей лампы ДХО предполагает предварительный поворот патрона против часовой стрелки, после чего его извлекаем из посадочного гнезда. Вынув старую лампу, монтируем новый элемент в патронный паз. Теперь закручиваем сам патрон в блок.

Внимание! Смена галогенных устройств не «терпит» касания пальцами к поверхности их колб.

Это связано с риском оставления отпечатков от потожировых выделений, что негативно сказывается на ресурсе прибора. Рекомендуем в работе пользоваться хлопчатобумажными перчатками, не имеющими резинового напыления на рабочих зонах. Перед монтажом ламп на LADA Granta их колбы протирайте спиртосодержащими салфетками. Именно так и происходит замена лампы ходовых огней.

Диодные ходовые огни

Обозначенный процесс замены ламп на Лада Гранта не предполагает обладания владельцем сверх — способностей, однако сопряжен с некоторыми незначительными нюансами.

  1. Замена лампы ходовых огней на светодиодные аналоги предполагает свое выполнение одновременно в обеих фарах.
  2. При монтаже светодиодных устройств требуется обязательное соблюдение полярности их подключения.

Внимание! Если не учесть необходимость обеспечения полярности, то это приводит к мгновенному выходу из строя самого осветительного устройства. Кроме того, в зону риска попадает предохранитель, защищающий цепь ДХО.

К проверке полярности огней на LADA Granta следует привлекать тестер с включенным в нем режимом вольтметра. Перед извлечением отработанных ламп включаем ДХО. Когда контакты приемников получают напряжение, к их поверхности подносим щупы вольтметра (красный с черным). Смотрим на показания и, если обнаруживаем отрицательное значение, то это свидетельствует о нарушении порядка (полярности) подключения. Цифровой тестер в таком случае выводит на экран «минус», а аналоговый – «загоняет» стрелку ниже «нуля».

Особенности монтажа светодиодных ДХО

Если не удалось отыскать устройства для Лада Гранта без цоколей, то можно остановиться на применении обычных изделий. Здесь понадобится собственноручное удаление цоколя, а его освободившиеся контакты требуется подгонять под монтажные отверстия.

После завершения процедуры замененные приборы не следует выбрасывать. Это объясняется потребностью соблюдения регламента, регулирующего нормативно-технические требования к аспектам дневного освещения, что предполагает посещение тех-центра. Если этим пренебречь, то возможен риск запрещения эксплуатации автомобиля с доработанной таким образом светотехникой при очередном техосмотре.

Сегодня рыночная сеть способна предложить массу светодиодных устройств для LADA Granta, обладающих разным спектром освещения. Однако регламентные нормы говорят о допустимости только белого или желтого оттенка для ДХО, а остальные альтернативы запрещены.

Приборы на светодиодной технологии, в том числе и лампы ДХО отличаются от галогенных сравнительно меньшим потреблением энергии. Это позволит в дальнейшем снизить уровень нагрузки на АКБ. Забыв однажды деактивировать ДХО на ночь, вы все равно минимизируете риск разрядки аккумулятора.

Конструктивное устройство системы освещения Лада Гранта предполагает присутствие в схеме реле, несущего ответственность за обеспечение функционала ДХО. Кроме этого, данное устройство обеспечивает подачу питания к стоп-сигналам и инжектору. Ввиду сниженного энергопотребления светодиодных устройств на авто LADA Granta, реле способно генерировать некорректные показания, сетуя на неисправность ДХО. При такой картине лампа ходовых огней на «приборке» будет активироваться с надоедливой частотой, а встроенный диагностический комплекс издавать звуковые сигналы. Чтобы ликвидировать проблему, потребуется замена стандартной панели на экспортный аналог, устанавливаемый в европейские версии Лада Гранта. А как поменять лампочку ходовых огней мы описали выше.

Как заменить дневные ходовые огни на Гранте своими руками пошаговая инструкция

Выбирая светодиодные лампы для авто, большинство даже не знают требования к их яркости, хотя это самое важное, что надо знать. Обычно получается, что, делая покупки в интернет-магазинах, вы прислушиваетесь к советам и рекомендациям консультантов из магазина, ведь специалист советует, и зачастую они вам предлагают попробовать: лампочки в дневные ходовые огни (ДХО) на 400-500 Лм; для ближнего света на 700 Лм; светодиоды в противотуманные фары (ПТФ) со световым потоком 600 Лм; про каждую вам скажут, что она ярко светит и подходит, хотя это не так.

В итоге вы устанавливаете их, они не дают желаемого результата, Вы остаетесь недовольны и покупки забрасываете на дальнюю полочку в шкафчик.

Лампа ДХО Лада Гранта — это осветительный прибор для дневных ходовых огней. В автомобилях этой марки функцию таких огней выполняют лампы габаритов.

Причины выхода из строя дневных ходовых огней Свет стандартной лампы ДХО Гранта установленный с завода изготовителя

Причин выхода из строя дневных ходовых огней на Ладе Гранта может быть очень много вот наиболее распространенные из них:

  1. Перегорела лампа. Наверное, самая безобидная причина, так как для ремонта потребуется замена лампочки.
  2. Несоблюдение полярности при установке осветительных источников;
  3. По каким-то причина перестал работать канал поворотника;
  4. вышел из строя предохранительный элемент или реле, необходимо проверить их работоспособность;
  5. Перегорание нити накаливания;
  6. Повреждение проводки;
  7. Выход из строя или плохой контакт на подрулевом переключателе либо кнопке включения фар.

В случае частого перегорания ламп в дневных ходовых огнях рекомендуем вам обратиться к специалисту для выяснения причин, так как неисправность и повреждение проводки может привести к более серьезным последствиям.

Когда следует менять лампы ?

Каких-то определенных регламентов и рекомендаций по срокам замены ламп в дневных ходовых огнях на Ладе Гранта не существует. Деталь заменяется после перегорания. (выходе из строя)

Рекомендуем вам прочитать статью: Как заменить лампы ближнего света на Ладе Гранта

Видео: Причины выхода из строя ДХО на Гранте

Особенности выбора

Необходимого повышения яркости или срока эксплуатации лампочек можно добиться, лишь произведя замену действующих огней. Часто автолюбители заменяют установленные в «Ладе» галогенные источники освещения на светодиодные. Как правило, с этой задачей сможет справиться даже человек без опыта замены ламп.

Однако следует знать несколько нюансов. Просто поставить новый диод на нужное место недостаточно — у процесса есть свои особенности. 

Лампы повышенного визуального комфорта

Хотя штатные лампы с желтоватым тусклым оттенком в системе ходовых огней могут оставаться еще вполне исправными, многие владельцы Лады Гранта стремятся сразу выполнить их замену на галогенные с ярким белым светом. Причина этого – повышение визуального комфорта. Также отмечается, что это способно подчеркнуть экстерьер профиля авто.

Сравнение ламп ДХО – на фото представлена стандартная (установленная с завода изготовителя) и лампа повышенной комфортности

Большой популярностью среди автолюбителей пользуются галогенные лампочки следующих производителей:

  1. Philips.
  2. Маяк.
  3. OSRAM.
  4. IPF.
  5. General Electric и некоторых других.

Как и прочие модификации галогеновые лампы для ДХО имеют все тот же характерный ряд недостатков. Это прежде всего повышенный нагрев и снижающийся с повышением мощности из-за этого срок годности. По этой причине при выборе подобных источников для Лада Граната следует учесть, что они могут выпускаться в двух версиях:

Первый вариант отвечает всем требованиям законодательства, но при этом имеет среднюю долговечность. Второй – более экономичен и, хотя светит не так ярко, зато служит дольше.

Дневные ходовые огни на основе диодов

Перед тем как начать самостоятельную установку дневных световых огней со светодиодами на Ладу Гранта необходимо запомнить: габаритные огни ни в коем случаи не должны быть использованы в качестве дневных ходовых огней. Для этого у них попросту не хватит мощности светового излучения.

Что касается дневных ходовых огней Гранты, то они очень быстро и довольно легко модернизируются. Ни без финансовых вливаний, но бесплатным в этом мире ничего не бывает.

Для тюнинга дневных ходовых огней Lada Granta достаточно прибегнуть к замене галогенных ламп светодиодами.

Купить диодные лампы можно практически в любом автомагазине. Стоить они будут в разы дороже, чем стандартные лампы накаливания заводской сборки, но, с другой стороны, долговечность и эффективность у них тоже выше. В уме прагматичного автомобилиста чаша весов должна перевесить в пользу более привлекательного, хоть и дорогого, товара.

Процесс установки лампы ДХО Лада Гранта

При выборе auto led lamp хозяин авто должен учесть: у ламп ходовых огней отсутствует цоколь. Хотя, если вы приобрели светодиоды с его наличием – это ещё не конец света. Есть два варианта выхода из затруднения:

  1. обмен светодиодов при условии сохранения чека, либо же налаженных контактов с продавцом;
  2. аккуратное отделение цоколя от светодиодной лампочки.

Оба выхода из ситуации приемлемы. Никаких трудностей на пути к их осуществлению не должно возникнуть.

Возможно вас заинтересует: Неисправности и замена стоп сигналов на Ладе Гранта

Как заменить лампы дневных ходовых огней на Гранте
  1. Отсоединяем клеммы от АКБ
  2. В подкапотном пространстве находим проводку которая ведет к нашей ДХО
  3. Берем и поворачиваем лампу против часовой стрелки
  4. Вынимаем лампу из лотка
  5. Извлекаем перегоревшую лампу (вытягиваем ее на себя)
  6. Устанавливаем новую лампу ДХО и собираем все в обратной последовательности

Видео: Пошаговая инструкция замены лампы ДХО на Гранте

Лампа ДХО Лада Гранта: замена и характеристики

Лампа ДХО Лада Гранта — это осветительный прибор для дневных ходовых огней. В автомобилях этой марки функцию таких огней выполняют лампы габаритов. В технической литературе они так и называются: двухнитевые лампы габаритного и дневного ходового огня (ДХО). При включении зажигания загорается 21-ваттная нить ходовых огней, а при включении фар — 5-ваттная нить габаритов.

Изготовитель комплектует Ладу Гранта самыми простыми и недорогими лампами ДХО. Недостатков у них много, а преимущество только одно — низкая цена. Одними из главных покупательских рекламаций на эти лампы являются тусклый желтоватый свет и очень низкий ресурс при эксплуатации.

Автолюбители, не желающие мириться с недостатками стандартных дневных ходовых огней, заменяют их другими моделями при первой же возможности. В качестве источников света подходят светодиодные лампы без цокольной сборки или лампы повышенного визуального комфорта. Ассортимент таких ламп достаточно широк, найти их можно практически в любом магазине автозапчастей. При выборе источников светодиодного освещения специалисты рекомендуют руководствоваться параметром яркости.

Лампы повышенного визуального комфорта

Лампа ДХО Лада Гранта повышенной комфортности представляет собой обыкновенные галогенные лампы накаливания ближнего света, светящие белым. Основным недостатком является ухудшенная видимость в дождливую погоду из-за того, что белый свет дает намного больше бликов от мокрых поверхностей и капель дождя, чем желтый.

В продаже чаще встречаются следующие марки галогенных лам высокого комфорта: OSRAM, General Electric, Маяк, Philips, Narva, IPF, Hella и др. Производитель рекомендует выбирать модели OSRAM h5 в модификациях Standard и Light Day. Первая полностью соответствует всем нормам и требованиям законодательства по безопасности, освещенности, геометрии и точности светотеневой границы. Имеет самое высокое значение силы света. Вторая модель отличается от первой значительно более высоким сроком службы. По силе света немного уступает модификации Standard.

Замена ламп ближнего света осуществляется так. Освободите доступ к левой блок-фаре. Для этого освободите корпус воздушного фильтра Лады от всех креплений, отсоедините жгут проводов и датчик. Затем сдвиньте корпус фильтра вверх и влево. Чтобы получить доступ к правой блок-фаре, необходимо снять крышку силового агрегата. Для этого отвинтите крышку маслозаливной горловины, а затем 4 крепежных болта. После этого потяните крышку вверх и отщелкните ее.

Чтобы извлечь старую лампу, сначала поверните патрон против часовой стрелки, после чего аккуратно вытягивайте источник света. Новую устанавливайте в обратном порядке: сначала установите цоколь в паз патрона, затем закрутите патрон по часовой стрелке.

Обратите внимание: при замене галогенных ламп не рекомендуется касаться колб пальцами.

Дело в том, что потожировые следы от пальцев на колбах световых приборов многократно сокращают их ресурс. Поэтому работать необходимо в чистых хлопчатобумажных перчатках без напыления из резины. Сами колбы перед установкой протрите спиртовыми салфетками.

Дневные ходовые огни на основе диодов

Замена ламп накаливания и установка светодиодов на автомобиле Лада Гранта не требует особых навыков, но имеет некоторые нюансы. Во-первых, лампы в обеих фарах должны заменяться одновременно: если меняете одну лампу накаливания на светодиодную, то другую тоже обязательно смените. Во-вторых, замена ламп на светодиодные источники освещения требует обязательного соблюдения полярности питания.

Обратите внимание: при попытке установки светодиодной лампы без соблюдения полярности она мгновенно выходит из строя. Более того, существует высокая вероятность выхода из строя предохранителя питания ламп ДХО. Поэтому, если все же ваши действия привели к перегоранию прибора, перед новой попыткой обязательно меняйте предохранитель.

Полярность контактов определяется с помощью вольтметра (тестера). После того как старые лампы будут извлечены, необходимо включить дневные ходовые огни, чтобы на контакты подавалось напряжение. Затем красный щуп вольтметра подключаете к одному контакту, черный — к другому. Если прибор покажет положительное напряжение, то красный щуп будет соответствовать «плюсу», а черный — «минусу». Если вольтметр показывает отрицательное постоянное напряжение, значит, провода подключены наоборот: красный — к «минусу», черный — к «плюсу».

При этом цифровой тестер отрицательное напряжение будет выдавать со знаком «минус», а показания стрелочного вольтметра уйдут ниже нуля.

Нюансы установки светодиодных ламп ДХО

Если не нашлось бесцокольных светодиодных ламп для Лада Гранта, можно установить обыкновенные цокольные. При этом придется самостоятельно удалить цоколь с диода, а освободившиеся усики подогнать под установочные отверстия.

После окончания замены ламп не выкидывайте старые галогеновые приборы. Дело в том, что для соблюдения нормативно-технических требований к дневному свету после установки новых ламп нужно будет посетить техцентр. В противном случае очередной плановый техосмотр запретит эксплуатацию авто с такими доработанными фарами.

В продаже имеется множество светодиодных источников света различных цветов и оттенков. Но по нормам испускаемый дневными ходовыми огнями свет должен быть только белым или желтым. Все остальные цвета запрещены.

Светодиодные лампы потребляют значительно меньшее количество электроэнергии, чем стандартные лампы накаливания. Поэтому установка светодиодных огней существенно снизит нагрузку на аккумулятор. Если вы забудете выключить на ночь ходовые огни, к утру аккумулятор почти не разрядится.

Конструкцией автомобиля Лада Гранта предусмотрено реле, контролирующее исправность ДХО. Кроме того, это реле одновременно следит за функционированием инжектора и стоп-сигналов. Учитывая, что светодиодные лампы потребляют меньше энергии, реле контроля может давать ошибочные показания, сигнализируя о том, что ходовые огни неисправны. То есть лампа ДХО на приборной панели будет часто включаться, а бортовая диагностическая система постоянно пищать.

Чтобы избавиться от подобной проблемы, необходимо заменить стандартную приборную панель ее экспортным вариантом, предназначенным для европейских вариантов Лада Гранта.

🚘 Устанавливаем ДХО на Ладу Гранта

В соответствии с регламентом об эксплуатации транспортных средств, каждый автомобиль на дороге должен быть обозначен дневным ходовым огнем или ближним светом фар, если дневной ходовой огонь отсутствует. Делается это, прежде всего, для безопасности, ведь даже при условиях отличной видимости ходовые огни едущего в потоке автомобиля привлекают внимание других участников движения, снижая аварийность на дороге. Автомобили марки Лада всего модельного ряда оснащаются штатно с завода ходовым огнем, чаще всего это обычная лампа накаливания, размещенная в блок фаре или выполненная в роле отдельного модуля. Однако яркость лампы накаливания достаточно ограничена, но увеличить силу света можно путем установки качественных светодиодных ламп. Помимо прочего хорошие светодиоды более долговечные, чем лампы накаливания и потребляют в два—три раза меньше электроэнергии, что позволит немного сэкономить на топливе. Так же для многих важный параметр, светодиоды имеют чистый и белый оттенок, установка светодиодов или осветительных приборов отличных от желтого или белого оттенка запрещено регламентом об эксплуатации транспортных средств. Применение не санкционированного светового оборудования чревато лишением права управления автомобилем и отправкой его на штраф стоянку.

Особенность дневного ходового огня Лада Гранта и Лада Калина заключается в том, что в проводке применяется достаточно редкая распиновка разъема SRSK, которая применяется больше у автомобилей импортного производства. В результате этого хорошие лампы, которые мы бы могли советовать вам к установке стоят весьма дорого, порой в десятки раз дороже лампы накаливания. Однако если цена вопроса вас не пугает, выбирайте качественные лампы с соответствующей схемой питания и устанавливайте их согласно инструкции. Применять лампы иного принципа питания не безопасно для проводки автомобиля и работать они будут некорректно, либо не будут вовсе.

При замене лампы с пассажиркой стороны возникнуть проблем не должно, поскольку доступ к цоколю лампы полностью открыт. Для замены лампы накаливания на светодиодную нам потребуется провернуть цоколь на 45 градусов вокруг своей оси и аккуратно вытащить его из посадочного места.

Новая лампа вставляется плотно до упора. Особенность распиновки SRSK применяемой на автомобилях Лада в том, что «плюс» и «минус» питания расположены отдельно друг от друга на каждой из сторон и если лампа не биполярная, то работать она будет только при установке ее определенной стороной. Советуем вам включить габаритный огонь, чтобы точно не ошибиться при установке новой лампы, при корректной установке она сразу же заработает.

С водительской стороны замена лампы осложнена наличием корпуса воздушного фильтра перед цоколем лампы, однако это не сильно затруднит этот процесс.

Тянем вверх резиновые грибочки крепления корпуса фильтра к корпусу и отводим его в сторону, обеспечивая доступ к цоколю лампы. Сам процесс замены аналогичен лампе с другой стороны.

Спасибо за подписку!

Применение качественных светодиодных ламп позволит значительно увеличить яркость свечения ходового огня, что отлично видно на фото. По нашим замерам яркость увеличилась 50% по сравнению с лампой накаливания.

Но особенно заметно качественное улучшение освещения при работе в режиме габаритов. Светодиодные лампы эффективнее в данном режиме работы более чем на 300%. Трудно переоценить вклад в безопасность при нахождении автомобиля на дороге с четко обозначающим его габаритном огнем.

Нагрузка на питающую бортовую сеть при этом значительно снизилась. Если штатная лампа накаливания потребляет в режиме дневного ходового одна 21 Ватт мощности, то большая по яркости светодиодная лампа потребляет лишь 7 Ватт, что всего на 2 Ватта больше потребления ламп накаливания в режиме габаритного огня.

Fretlight LED обучающая гитара освещает путь к быстрому и легкому обучению

Должен признаться, с оттенком печали, когда я сообщаю, что оба светодиодных обучающих рукава для гитарных проектов, которые мы представили еще в апреле, до сих пор не появились. Сообщается, что разработка каждого из них продолжается, но Tabber прекратил свое присутствие на Kickstarter всего через две недели, чтобы перегруппироваться и улучшить продукт, и LED Sleeve не попал в цель финансирования. К счастью, существует существующая система под названием Fretlight, в которой используются встроенные в шею источники света, чтобы показать потенциальным игрокам, когда и где положить пальцы на гриф.Недавнее добавление в модельный ряд довольно привлекательной электрогитары FG-461 PRO предоставило прекрасную возможность познакомиться поближе.

В то время как у гитаристов, таких как Клэптон, Пейдж и Бек (или в последнее время Сатриани, Вай и Гилберт), игра на шестиструнном электрическом саксофоне выглядит такой простой и естественной, но это не так. Все это виртуозное мастерство - результат бесчисленных часов, потраченных на вырубку отбивных, изучение гамм и совершенствование техники. Многие, кто пытается подражать своим гитарным героям, будут искать помощи в книгах, видео и компьютерном программном обеспечении, но нет ничего лучше, чем иметь рядом кого-то, кто точно покажет вам, что нужно делать, где и когда.

К сожалению, профессиональное обучение может быть дорогостоящим, и в конце всегда слишком короткого урока ученики предоставлены сами себе и, вероятно, должны будут вернуться к счету чтения или счету из книги, переведя его на положение на шее и затем бесконечно повторять пьесу, постепенно увеличивая ее до нужного темпа. Видеоуроки и пакеты обучения программному обеспечению предлагают дополнительную интерактивность, но учащимся все равно придется переключать фокус с экрана на инструмент и обратно, что может несколько отвлекать.

Гитара Fretlight имеет стандартный выходной разъем для подключения инструмента к усилителю и 8-контактный порт для подключения к компьютеру.

Метод обучения Fretlight, разработанный Расти Шаффером, имеет светодиодные фонари, расположенные на ладах вдоль шеи гитары, которые работают вместе с видео и программным обучением, чтобы позволить игрокам овладеть новыми навыками (или освежить существующие) в десять раз быстрее, чем со знакомыми методы обучения, такие как книги, DVD или онлайн-инструкции.В отличие от проектов Kickstarter, упомянутых выше (где тонкая упаковка со светодиодами будет помещена под струны практически любой гитары), система Fretlight встроена в линейку из пяти современных электрогитар, вдохновленных классические формы кузова Fender.

Каждая модель имеет тонкий слой светодиодной схемы, увенчанный усовершенствованной полимерной накладкой, которая позволяет свету просвечивать только при включении. На гайке есть световая полоса, указывающая на открытые струны, и светодиод под каждой струной в 21 из 22 позиций лада вдоль грифа.Индикаторы включаются в ответ на видеоуроки и / или программное обеспечение на компьютере, которые проводят учащихся через фразы, прогрессии, гаммы, полные песни и многое другое, указывая, где и когда нужно нажимать струну.

Каждая покупка поставляется с кабелем для подключения гитары к USB длиной 3 метра и программным обеспечением Fretlight Studio для Mac / ПК, которое включает более 100 текстовых уроков и позволяет игрокам джемовать под несколько включенных минусовок. . Студенты могут даже синхронизировать систему освещения с тем, что инструктор играет в постоянно растущей линейке видеоуроков Hal Leonard Fretlight Ready.Каталог для последнего в настоящее время включает в себя руководства о том, как играть, как Клэптон, Билли Ф. Гиббонс (ZZ Top), Боб Сегер, Леннон и Маккартни, Стиви Рэй Воган, Лесли Уэст (Маунтин), BB King и другие. Рекомендуемая розничная цена каждого пакета видеоуроков составляет от 18,99 до 23,99 долларов США.

Первый взгляд (проводной FG-400/500)

Новейшее дополнение к семейству Fretlight - 12-фунтовая (5.4 кг) FG-461 PRO, корпус из ясеня с великолепным кленом типа «птичий глаз» сверху и окрашенный в синий или натуральный цвет. Есть 25,5-дюймовый гриф Stratabond C-образной формы с двухсторонней анкерной стойкой, фиксированный мост на одном конце инструмента и блокирующие тюнеры на другом, а между ними - сверхтихие звукосниматели Lindy Fralin Single Coil P-92. В дополнение к ручкам громкости и тембра и вместо знакомого трех- или пятипозиционного переключателя PRO имеет ручку блендера, которая, как говорят, позволяет пользователям точно выбирать, какое влияние каждый из двух звукоснимателей оказывает на звук. тон произведен.

Последнее дополнение к семейству Fretlight: электрогитара FG-461 PRO

Гитары Fretlight начального уровня стоят 399,99 долларов, есть модель Strat за 499,99 долларов, форма Tele - 599,99 долларов, красивая версия Jazzmaster за 699,99 долларов, а модель Pro, описанная выше, будет стоить вам 1199,99 долларов.

Fretlight FG-461 Pro Electric

Источник: Fretlight

Спектральная фокусировка широкополосной электролюминесценции серебра в наноскопических светодиодах FRET

  • 1

    Непийко, С.A. et al. Излучение света кластерными пленками Ag при возбуждении током проводимости. Ann. Phys . 9 , 125–131 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 2

    Borzjak, P.G. et al. Neue Erscheinungen in sehr dünnen Metallschichten. Phys. Стат. сол. 8 , 55–58 (1965).

    Артикул Google Scholar

  • 3

    Ламбе, Дж.и другие. Излучение света при неупругом электронном туннелировании. Phys. Rev. Lett . 37 , 923 (1976).

    CAS Статья Google Scholar

  • 4

    Gonzalez, J. I. et al. Квантово-механический электролюминесцентный источник света на основе одного нанокластера золота при комнатной температуре. Phys. Rev. Lett . 93 , 147402 (2004).

    Артикул Google Scholar

  • 5

    Ли Т.H. et al. Одномолекулярная оптоэлектроника. В соотв. Chem. Res . 38 , 534–541 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 6

    Kern, J. et al. Оптические антенны с электрическим приводом. Nat. Фотон . 9 , 582–586 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 7

    Nilius, N. et al. Фотонная эмиссионная спектроскопия отдельных кластеров серебра на оксидной основе в сканирующем туннельном микроскопе. Phys. Rev. Lett . 84 , 3994 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 8

    Berndt, R. et al. Неупругое туннельное возбуждение индуцированных иглой плазмонных мод на поверхности благородных металлов. Phys. Rev. Lett . 67 , 3796–3799 (1991).

    CAS Статья Google Scholar

  • 9

    Chen, C. et al. Визуализация золотого правила Ферми посредством визуализации светового излучения цепочек атомов серебра. Наука 325 , 981–985 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 10

    Мак, К. Ф. и др. Атомно тонкий MoS2: новый прямозонный полупроводник. Phys. Rev. Lett . 105 , 136805 (2010).

    Артикул Google Scholar

  • 11

    Mueller, T. et al. Эффективное узкополосное излучение света от одиночного p – n-диода из углеродных нанотрубок. Nat. Нанотех. 5 , 27–31 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 12

    Klein, D. L. et al. Одноэлектронный транзистор из нанокристалла селенида кадмия. Nature 389 , 699–701 (1997).

    CAS Статья Google Scholar

  • 13

    Schneider, N. L. et al. Оптический зонд уменьшения квантового дробового шума при одноатомном контакте. Phys. Rev. Lett . 105 , 026601 (2010).

    Артикул Google Scholar

  • 14

    Coe, S. et al. Электролюминесценция одиночных монослоев нанокристаллов в молекулярно-органических устройствах. Природа 420 , 800–803 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 15

    Achermann, M. et al. Накачка с переносом энергии полупроводниковых нанокристаллов с помощью эпитаксиальной квантовой ямы. Природа 429 , 642–646 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 16

    Castellanos-Gomez, A. et al. Детерминированный перенос двухмерных материалов методом сухой вязкоупругой штамповки. 2D Материал . 1 , 011002 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 17

    Баугер, Б. В. Х. и др. Оптоэлектронные устройства на основе электрически перестраиваемых p − n-диодов в однослойном дихалькогениде. Nat. Нанотех . 9 , 262–267 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 18

    Росс, Дж. С. и др. Электроперестраиваемые экситонные светодиоды на основе однослойных p − n-переходов WSe2. Nat. Нанотех . 9 , 268–272 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 19

    Сундарам Р. С. и др. Электролюминесценция в однослойном MoS2. Нано Летт . 13 , 1416–1421 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 20

    Silly, F. et al. Автокорреляция по времени в излучении фотонов с металлической поверхности, индуцированном сканирующим туннельным микроскопом. Прил. Phys. Lett . 77 , 3648 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 21

    Барнс, В. Л. Флуоресценция вблизи границ раздела: роль плотности фотонных мод. J. Mod. Опция . 45 , 661–699 (1998).

    CAS Статья Google Scholar

  • 22

    Чижик А.И. и др. Передача энергии под действием металлов для наноскопии живых клеток. Nat. Фотон . 8 , 124–127 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 23

    Дрексхаге, К. Х. Влияние диэлектрической границы раздела на время затухания флуоресценции. Дж. Люмин . 1 , 693–701 (1970).

    Артикул Google Scholar

  • 24

    Swathi, R. S. et al. Дальнодействующий резонансный перенос энергии от молекулы красителя к графену имеет зависимость (расстояние) (- 4). J. Chem. Phys . 130 , 086101 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 25

    Prins, F. et al. Уменьшение диэлектрического экранирования и улучшенная передача энергии в однослойном и малослойном MoS2. Нано Летт . 14 , 6087–6091 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 26

    Raja, A. et al. Передача энергии от квантовых точек к графену и MoS2: роль поглощения и экранирования в двумерных материалах. Нано Летт . 16 , 2328–2333 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 27

    Poellmann, C.и другие. Резонансные внутренние квантовые переходы и фемтосекундный радиационный распад экситонов в монослое WSe2. Nat. Mater . 14 , 889–893 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 28

    Черников А.А. и др. Энергия связи экситона и неводородный ряд Ридберга в монослое WS2. Phys. Rev. Lett . 113 , 076802 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 29

    Li, Y.и другие. Измерение оптической диэлектрической проницаемости однослойных дихалькогенидов переходных металлов: MoS2, MoSe2, WS2 и WSe2. Phys. Ред. B 90 , 205422 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 30

    Plechinger, G. et al. Контроль двухосной деформации однослойного молибденита с помощью локального теплового расширения подложки. 2D Материал . 2 , 015006 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 31

    Чаудхури, Д.и другие. К субдифракционной просвечивающей микроскопии диффузных материалов с использованием маяков белого света с наночастицами серебра. Нано Летт . 9 , 952–956 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 32

    Bao, W. et al. Визуализация наноразмерных свойств экситонной релаксации неупорядоченных краев и границ зерен в монослое дисульфида молибдена. Nat. Коммуна . 6 , 7993 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • Гранты на легкую работу / легкую работу

    1997
    Марк Элис Дюрант, Мэри Бет Хеффернан, Мэри Уорнер Мариен
    Жюри: Тереза ​​Маллиган, Роберт Флинт

    1996
    Винсент Боррелли, Джина Муртаг, Эдриенн Сэлинджер
    Жюри: Гейл Николсон, Рик Хок, Дебора Брайт

    1995
    Бретт Бут, Сара Каннингем, Линн Андерхилл, Эмиль Вамстекер
    Жюри: Боб Хирш, Натан Лайонс, Хулли Цинхнахджинни

    1994
    Брантли Кэрролл, Рея Грин, Дэвид Мур, Дайан Нервен
    Жюри: Карлос Гутьеррес-Солана, Коко Фуско, Патти Амброджи

    1993
    Элеонора Хассет, Хайди Кумао, Стивен Скопик
    Жюри: Керри Коппин, Боб Хирш, Линн Лав

    1992
    Шерри Чаят, Сильвия де Сваан, Майкл Гринлар, Аллин Стюарт
    Жюри: Гейл Николсон, Детлеф Хенрикс

    1991
    Лаура Кано Бланко, Даррелл Мацумото, Джон Рейс, Уильям Стаффилд
    Жюри: Карл Беверидж, Хилтон Брейтуэйт, Кэрол Конде

    1990
    Винсент Боррелли, Нэнси Кончар, Джейсон Махши, Кристиан Сунде
    Жюри: Марион Фаллер, Сидней Уоллер, Джеймс Вайман

    1989
    Тирза Девлин, Стивен Махан III, Мэри Уорнер Мариен, Адриенн Сэлинджер
    Жюри: Франсуа Дешам, Лоррейн Кенни, Джон Вуд

    1988
    Кортни Фрисс, Мари Парсонс, Родерик Л.Саттон, Брюс Райтон
    Жюри: Мона Хименес, Эйприл Хикокс, Тайрон Георгиу

    1987
    Люк Баффенмайер, Маргарет Фабрицио, Джефф Кох, Присцилла Смит
    Жюри: Тони Бэннон, Скотт Маккарни, Коллин Кеньон

    1986
    Том Браун, Кэти Моррис, Дуг Принс, Линн Шварцер
    Жюри: Шерил Брутван, Джинна Мозесон, Роджер Фриман

    1985
    Рита Дайерлейн, Джон Фуллер, Розмари Имхофф, Кейт Тишкен
    Жюри: Брайан Огелсби, Дэвид Тренд, Кэтлин Кенион

    1984
    Делия Хэтч Барони, Эллен М.Блэлок, Монте Герлах, Дон Трейси
    Жюри: Робин Доддс, Нэнси Гончар, Роджер Уильямс

    1983
    Джейн Бэр, Джон Кнехт, Лорна Лентини, Лори Сивертс Снайдер
    Жюри: Гэри Никард, Дон Рассел, Джуди Натал

    1982
    Сьюзан Броди, Майкл Дэвис, Тед Даймонд, Дженис Джарракко, Дэвид Мур
    Жюри: Мартин Бенджамин, Сьюзан Шоу, Кристина Юин

    1981
    F-Stop Fitzgerald (он же Ричард Миниссали), Роберт Фостер, Пол Пирс, Джейн Стивервальд
    Жюри: Бонни Гордон, Рик Хок, Бифф Хенрих

    1980
    Дин Абрамсон, Джеффри Хун, Мэриан Рот, Карен Вурнанс
    Жюри: Роберт Бретц, Кэти Коллинз, Коллин Кеньон

    1979
    Джуди Иври, Джон Рейс, Марджори Теппер, Джеймс Торп
    Жюри: Боб Хауэр, Микаэла Мерфи, Джоэл Шварц

    1978
    Дэвид Брода, Мима Катальдо, Люсинда Девлин, Ричард Лафлин

    1977
    Сильвия де Суан-Эймс, Питер Глендиннинг, Кен Хобарт, Фонд «Идиллический»
    Жюри: Хелен Бруннер, Джилл Фридман, Кэл Коваль

    1976
    Сесил Дорман, Марион Фаллер, Жюль Фрид, Рита Хаммонд
    Жюри: Рон МакНил, Мелисса Шук, Джеффри Силверторн

    1975
    Карл Баден, Бен Левин, Уоррен Уиллер

    FRET-опосредованная трансформация длин волн с помощью фотоконвертируемых флуоресцентных белков как эффективный механизм генерации оранжево-красного света в симбиотических глубоководных кораллах

    В условиях растущего антропогенного давления на мелководные рифы [39] мезофотические экосистемы были предложены в качестве потенциальных убежищ. для коралловых сообществ [40,41].Поскольку световая среда резко меняется с глубиной, знание того, как кораллы и их симбиотические водоросли могут справляться с низкой освещенностью и узкими спектрами, имеет решающее значение для понимания способности различных видов выживать на больших глубинах.

    pcRFP чаще всего встречались у глубинных кораллов-универсалов [3] и встречались у особей, собранных на мезофотических глубинах [33]. Их экспрессия не регулируется на уровне транскрипции интенсивностью света по сравнению с аналогами у мелководных кораллов [5,30,35].Вместе с открытием того, что их красная флуоресценция находилась под положительным отбором во время эволюции коралловых FP [42], эти наблюдения предполагают, что эти пигменты могут быть частью стратегии адаптации к жизни в условиях низкой освещенности [27,43]. Красный флуоресцентный хромофор pcRFP, являющийся неотъемлемой частью их функции, генерируется посттрансляционной модификацией зеленого флуоресцентного предшественника в процессе фотопреобразования, индуцированном ближним УФ-светом. Однако, в то время как сине-зеленый свет проникает до нижних пределов эвфотической зоны, длины волн ближнего УФ, необходимые для фотопреобразования и поддержания красной флуоресценции в колониях кораллов, сильно ослабляются водяным столбом, опускаясь до очень низких уровней на мезофотических глубинах [ 43,44,45].Поэтому сомнительно, имеет ли какое-либо значение световое фотопреобразование для адаптации кораллов к естественной световой среде.

    3.1. Влияние спектрального качества на фотопреобразование pcRFP

    Используя узкополосную светодиодную технологию в экспериментальном исследовании, мы смогли ответить на этот вопрос и оценить влияние различных частей светового спектра на фотопреобразование коралловых pcRFP как in vivo, так и in vitro. Наш мезокосм-эксперимент продолжительностью более 120 дней показал, что спектральное качество оказывает сильное влияние на флуоресценцию кораллов, содержащих pcRFP.В узкополосном светодиодном спектре только кораллы, освещенные светом 412 нм, были способны сохранять соотношение красной и зеленой флуоресценции, сравнимое с тем, которое наблюдается при белом свете; кораллы, подвергшиеся воздействию света с длиной волны 448 и 476 нм, демонстрировали возрастающие уровни зеленой флуоресценции, что указывает на накопление непревращенных pcRFP в ткани.

    Свет с длиной волны 476 нм, использованный в нашем эксперименте, не имел спектрального перекрытия со спектром действия фотопреобразования [19,20], таким образом, он неэффективен для индукции посттрансляционной модификации как in vivo, так и in vitro.Наблюдаемое усиление зеленой флуоресценции отражает накопление непревращенного протеина в ткани, вызванное неспособностью вновь синтезированного протеина к фотопревращению в красную форму. В то же время красная флуоресценция уменьшалась из-за прогрессирующего распада фракции преобразованного белка, который, как ранее было показано, происходит в темноте с периодом полураспада ~ 20 дней [35], а также из-за фотообесцвечивания, вызванного длительным возбуждением хромофора с помощью Световая обработка 476 нм [35,46]. Воздействие на очищенные белки тех же условий освещения дало результаты, сопоставимые с результатами, полученными для живых колоний.

    Мы подвергли очищенные pcRFP воздействию света 412 нм с различной интенсивностью для имитации ослабления нисходящего ближнего УФ-излучения в местах обитания коралловых рифов [47]. Хотя между исследуемыми pcRFP существуют различия в индивидуальных скоростях фотопреобразования, все они демонстрировали экспоненциальное уменьшение, таким образом, казалось, что они полностью зависят от потока фотонов в ближнем УФ-диапазоне. Поскольку результаты нашего мезокосмического эксперимента показывают, что фотопреобразование in vivo зависит от ближнего УФ-излучения, мы предполагаем, что эта экспоненциальная тенденция также актуальна для живых кораллов in situ.Важно отметить, что даже при таком низком потоке фотонов, как 0,5 мкмоль фотонов · м −2 · с −1 , что соответствует значениям, измеренным на 80 м в Красном море [33], мы наблюдали успешную, хотя и медленную фотопреобразование EosFP, McavRFP и EechRFP всего через 2 часа воздействия. Это говорит о том, что, несмотря на более сильное ослабление УФ и ближнего УФ по сравнению с сине-зелеными длинами волн водным столбом, фотопреобразование pcRFP действительно может происходить в мезофотической зоне.

    3.2. Преобразование длины волны с помощью FRET

    Как показали наши эксперименты in vitro, частично преобразованные тетрамеры pcRFP представляют собой идеальные донорно-акцепторные пары FRET из-за близкого расположения зеленых и красных хромофоров в тетрамерной сборке белка [14,20].В результате зеленое излучение индивидуального тетрамера исчезает в присутствии даже одной фотопреобразованной субъединицы в EosFP [20]. Следовательно, процесс фотопреобразования изменит эмиссионные свойства pcRFP, начиная с пигмента, излучающего зеленый свет, который поглощает сине-зеленый свет, а затем перейдет к смеси хромофоров, излучающих зеленый и красный, которые все еще поглощают в основном сине-зеленый свет, но в основном излучают оранжево-красный свет. Это выглядит как интригующий механизм преобразования частей сине-зеленых волн, которые доминируют в подводном световом поле на больших глубинах, в оранжево-красные длины волн.Таким образом, кораллы могут компенсировать зависящее от глубины ослабление более длинноволнового света и создавать внутреннее световое поле, которое больше напоминает условия на мелководье.

    Чтобы оценить, может ли FRET быть механизмом трансформации длины волны у живых M. cavernosa , мы рассчитали полученное FRET излучение для колонии, предварительно обработанной светом 476 нм, подвергающимся фотопреобразованию. Это было достигнуто путем измерения излучения красного акцептора при возбуждении зеленого донора (FRET-сенсибилизированное излучение) и применения поправки для удаления спектрального вклада излучения донора и прямого возбуждения акцептора, подход, аналогичный используемой методологии с тремя фильтрами. в микроскопии FRET [48,49,50].

    С прогрессирующим появлением красной флуоресценции во время фотопреобразования мы наблюдали быстрое увеличение эмиссии, производной от FRET, что может быть связано с увеличением концентрации акцепторов [38]. В живых колониях стабилизацию уровней FRET можно ожидать из установившегося равновесия, которое является результатом непрерывного истощения красных акцепторных хромофоров в результате фотообесцвечивания и белкового обмена [20,35], а также конститутивной экспрессии pcRFP, которая дополняет пул зеленые донорные хромофоры [35].Таким образом, максимальное значение FRET для колонии в данном световом поле будет зависеть от: (i) количества фотонов, доступных для возбуждения красных и зеленых хромофоров, соответственно, вызывающих фотообесцвечивание напрямую и через FRET; 2) интенсивность света в спектральном диапазоне, эффективном для фотопреобразования; и (iii) скорость оборота белка.

    Через 22 часа при потоке фотонов 60 мкмоль · м −2 · с −1 , обеспечиваемом светодиодом с длиной волны 412 нм, полученное FRET излучение начало насыщаться и достигло максимума через 100 часов.Эти значения были сопоставимы со значениями, полученными при тех же условиях освещения в эксперименте с длительным воздействием. В то время как соотношение зеленых и красных флуоресцентных хромофоров у людей, подвергшихся обработке 412 нм, сравнимо с соотношением, определенным для кораллов, культивируемых при освещении галогенидами металлов, излучение как зеленого, так и красного флуоресценции ниже у последних кораллов. Вероятно, это связано с широким спектром света галогенидов металлов, который очень хорошо возбуждает оба типа хромофоров, что приводит к увеличению уровней фотообесцвечивания [20] и установлению равновесия, которое содержит меньше функциональных хромофоров.

    Следовательно, когда колонии, акклиматизированные к спектру галогенидов металлов, были перенесены в эксперименты со светодиодами, установившееся равновесие зеленых и красных хромофоров, характерное для условий света 412 нм, стало очевидным только после полного оборота пула пигментов, присутствующих в начало эксперимента, медленный процесс, который происходит с периодом полураспада около трех недель [35].

    При увеличении моделируемой глубины скорость фотоконверсии и фотообесцвечивания снижается, образуя колонии со смесью зеленых и красных хромофоров.Наши эксперименты in vitro с EosFP показывают, что наиболее эффективное преобразование сине-зеленых длин волн возбуждения в оранжево-красное флуоресцентное излучение достигается примерно при равных концентрациях зеленого донорного и красного акцепторного хромофоров. Хотя красно-зеленой конфигурации 1: 3 в одном тетрамере EosFP достаточно для получения эффективного FRET [20], в более сложных системах, таких как очищенные белки в растворе или нативные белки в тканях животных, соотношение 1: 1 максимизирует количество частично преобразованных тетрамеров, тем самым достигая наивысшего потенциала для FRET-опосредованного преобразования длины волны.Такое соотношение является результатом длительного воздействия на M. cavernosa светодиода с длиной волны 448 нм. Способность к фотопреобразованию этого источника света при потоке фотонов 60 мкмоль · м −2 · с −1 сопоставима с таковой светового поля Красного моря на глубине ~ 80 м. Следовательно, результаты этого эксперимента свидетельствуют о том, что производное FRET производство оранжево-красного света стимулируется в мезофотическом диапазоне глубин, несмотря на уменьшение количества света, эффективного для фотопреобразования.

    В pcRFP опосредованная FRET флуоресценция с максимумами возбуждения / испускания 506/581 нм приводит к стоксовому сдвигу на 75 нм и, следовательно, к эффективному переносу с короткой длины волны на длинную.Этот стоксов сдвиг почти в три раза больше по сравнению с красными флуоресцентными белками из мелководных кораллов [3,5], что позволяет предположить, что опосредованная FRET трансформация длины волны является эффективным механизмом дополнения кораллов и их симбиотических водорослей оранжево-красным светом, который становится на большей глубине все реже. Чтобы оценить эту гипотезу, мы сравнили потенциал преобразования длины волны сине-зеленого в желто-красный частично фотопревращенного EosFP и нефотоконвертируемого красного белка eqFP611 [9].Этот белок был выбран из-за его максимума поглощения, аналогичного таковому у красного EosFP, высокой степени созревания красного флуорофора, яркой флуоресценции и исключительно большого стоксова сдвига 52 нм [9]. Мы обнаружили, что частично преобразованный EosFP с соотношением красных: зеленых хромофоров ~ 1: 1 более чем в 3 раза эффективнее преобразовывает сине-зеленый свет в диапазон 550–700 нм (> 6 × в диапазоне 560–610 нм). чем такое же количество eqFP611. Принимая во внимание метаболические усилия, необходимые для достижения высоких концентраций пигментов, обнаруженных в коралловых тканях [2,5], наши результаты показывают, что FRET-опосредованное преобразование длины волны частично преобразованными pcRFP действительно является энергетически выгодным механизмом для получения оранжево-красного света.

    Примечательно, что эффективное связывание FRET в тетрамерной группе также было обнаружено в красном флуоресцентном белке drFP583 (DsRed) дискового анемона Discosoma sp. [7,51]. В этом белке смесь зеленых и красных хромофоров образуется в процессе созревания красного хромофора, что обусловлено светонезависимым окислением предшественника хромофора. Хотя флуоресцентные свойства как зеленого, так и красного хромофоров DsRed и pcRFP схожи, они развились независимо от общего зеленого флуоресцентного предка [3].Примечательно, что дисковые анемоны, ассоциированные с Symbiodinium , такие как Discosoma sp. часто обитают в затененных местообитаниях [52], что предполагает, что FRET-опосредованная трансформация длины волны развивалась как адаптация к средам с ограниченным освещением по крайней мере дважды.

    Было высказано предположение, что флуоресцентные пигменты мезофотических кораллов, таких как Leptoseris sp. действуют, чтобы изменить качество света, доступного симбионтам [27,33,42]. Наше исследование демонстрирует замечательный механизм, с помощью которого pcRFP могут точно настраивать внутренний световой климат симбиотических кораллов по крутому градиенту количества и качества света, который характеризует их среду обитания.Дальнейшая работа должна улучшить наше понимание важности оранжево-красного света, генерируемого FRET-опосредованной передачей длины волны, для адаптации к условиям низкой освещенности.

    Оценка степени молекулярного контакта между поверхностями целлюлозных волокон с помощью микроскопии FRET

    Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

    Следующее краткое введение в теорию Фёрстера было взято из книги Б.В. Ван дер Меер (Meer 2013) и частично основан на оригинальных статьях Фёрстера.Эффективность передачи энергии между донорным и акцепторным красителем зависит от расстояния между двумя молекулами и, в принципе, определяется радиусом Ферстера (\ (\ text {R} _0 \)). Радиус Ферстера можно рассчитать для любой комбинации донорных и акцепторных молекул, как показано в дополнительной информации (Таблица S1). \ (\ text {R} _0 \) специфичен для каждой пары донор-акцептор в конкретной системе. Эффективность передачи энергии (\ (\ eta _ {eff} \)) между донором и акцептором дается уравнением.6} \ end {align} $$

    (1)

    где r обозначает расстояние между донором и акцептором, а \ (\ text {R} _0 \) обозначает радиус Ферстера пары донор-акцептор. На практике эффективность FRET может быть измерена различными методами, которые могут быть реализованы либо в установках микроскопии, либо измерены с помощью спектрофотометрии, оба из которых были использованы в этой статье.

    Независимо от метода измерения, процесс FRET может быть обнаружен по различным аспектам эффекта.FRET изменяет интенсивность излучения донора (гашение донора), интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора), время жизни флуоресценции донора (измерения времени жизни) и поляризацию света (измерения анизотропии). Здесь мы использовали два из наиболее распространенных метода измерения FRET, а именно тушение донора (DQ) и акцепторную чувствительность (AS). Тушение донора измеряет уменьшение флуоресценции донора из-за FRET. Чувствительность акцептора измеряет увеличение флуоресценции акцептора из-за FRET.Хотя DQ является показателем для FRET, нельзя быть уверенным в этом, поскольку существуют другие механизмы, такие как гашение концентрации, которые могут дезактивировать возбужденный донор. С другой стороны, AS предоставляет убедительные доказательства для FRET, поскольку флуоресценция акцептора может быть увеличена только за счет некоторого рода передачи энергии (Meer 2013). Отличный обзор реализации и подводных камней метода предоставлен Broussard et al. (2013). Здесь следует упомянуть одну важную часть использования FRET - это тщательно проверять, действительно ли сигнал действителен, особенно когда спектроскопические данные недоступны.Это можно сделать, используя отрицательные контроли, динамический FRET или применяя более одного метода FRET.

    Материалы

    Красители 7- (диэтиламино) кумарин-3-карбогидразид (DCCH, Purity \ (95 {\%} \), CAS: 100343-98-4) и флуоресцеин-5-тиосемикарбазид (FTSC, Purity \ (99 {\%} \), CAS: 76863-28-0) были куплены у Santacruz Biotechnology. Растворители N, N-диметилформамид (DMF), тетрагидрофуран (THF) и ацетонитрил были приобретены в VWR. Все химические вещества использовались без дополнительной очистки.Поли (2-гидроксиэтилметакрилат) (pHEMA) для производства тонких пленок был приобретен у Sigma Aldrich. Модельные пленки наносились на фольгу из ПЭТФ. Используемая целлюлоза представляла собой небеленую крафт-целлюлозу из мягкой древесины промышленного производства.

    Подготовка образца

    Для исследования волокон целлюлозы [беленая крафт-древесина, соотношение ель / сосна (90/10)] образцы готовили, как описано Thomson et al. (2007). Волокна окрашивали в 15 мл раствора любого из красителей в ДМФА (1 ммоль / л и 0.2 ммоль / л) в течение ночи при pH 5, регулируемом добавлением HCl. Красители образуют метастабильную связь с восстанавливающим концом молекулы целлюлозы, и при добавлении HCl это равновесие смещается в сторону метастабильных видов связи. После окрашивания к раствору немедленно добавляли боргидрат натрия \ (\ hbox {NaBH} _4 \) (0,02 ммоль \ (\ text {NaBH} _4 \) на 0,5 г волокон) и давали ему прореагировать в течение 1 часа. Боргидрат натрия приводит к восстановительному аминированию красителей с целлюлозой, что приводит к ковалентной связи между реагентами.После этого восстановительного аминирования образцы сначала промывали в ДМФ и снова промывали экстракцией Сокслета ацетонитрилом в течение не менее 4 часов для удаления любого нековалентно связанного красителя. Впоследствии окрашенные волокна хранили в водном буферном растворе с pH 9 с использованием буры 0,4 г / л. Волокнистые связки были приготовлены путем скрещивания одного окрашенного DCCH волокна и одного окрашенного FTSC волокна в капле воды (pH 9) и последующей их сушки в листообразователе Rapid Köthen. Затем для микроскопии связки волокон переносили на предметные стекла.Перекрестки волокон (отрицательный контроль для FRET) получали путем простого пересечения двух волокон и покрытия их покровным стеклом для микроскопии.

    Модельные пленки были приготовлены методом докторблейдинга \ (500 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) \ (10 ​​{\%} \) pHema в растворе 95/5 EtOH / h3O, смешанном с растворенными красителями. в THF на полиэтиленовую пленку. Это привело к ок. \ (1.5 \, {\ upmu} \ hbox {m} \) толстая пленка. Для обеспечения щелочных условий к раствору добавляли объем \ (12 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) триэтиламина. Фольга ПЭТ была очищена ацетоном перед нанесением лака.\ circ \ hbox {C} \) для \ (3 \, \ hbox {h} \) для установления контакта. Концентрации и применяемые методы измерения для образцов можно увидеть в Таблице 1.

    Таблица 1 Концентрации и параметры для измерений FRET

    FRET из спектрофотометрии

    Спектры флуоресценции были записаны на RF-5301PC, спектрофлуорофотометре от Shimadzu. Эксперименты FRET проводились с концентрациями молекул, указанными в таблице 1. Также были приняты меры для минимизации воздействия окружающего света на любой из образцов во избежание фотообесцвечивания.Модельные пленки, с одной стороны, были исследованы с использованием этой установки флуорометрии, а с другой стороны, они были исследованы с помощью широкоугольного микроскопа с наборами фильтров, показанными в таблице 2. Спектры пленок pHema были записаны с использованием установки, показанной на рис. 3. Образцы исследовали под углом, который позволяет избежать обнаружения прямо отраженного света и измеряет только флуоресценцию, исходящую от образца.

    Рис. 3

    Установка для измерения пленок pHema во флуорометрии.В и настройка объясняется более подробно. Он был выбран таким образом, чтобы отраженный (REFL) луч, следующий за возбуждением (EX) образца, не попадал на детектор, и регистрировался только сигнал флуоресценции, испускаемый (EM) непосредственно от образца. a - c Образцы донора, акцептора и донора-акцептора во время их исследования

    Эффективность передачи энергии FRET рассчитывается по измеренным спектрам и поясняется на рис.4. Из-за передачи энергии излучение донора гасится (\ (\ text {I} _ {DA} \)) по сравнению с нормальным излучением донора (\ (\ text {I} _ {D} \) ). Энергия, не испускаемая донором, затем передается акцептору и увеличивает (или сенсибилизирует) излучение (\ (\ text {I} _ {AD} \)) по сравнению с нормальной чувствительностью акцептора (\ (\ text {I}) _ {A} \)). Спектральное перекрытие, показанное на рис. 4, является необходимым требованием для FRET и в значительной степени определяет диапазон расстояний эффекта, как можно увидеть в уравнении.{1/6} $$

    (2)

    \ (\ text {R} _0 \) - радиус Ферстера, k - фактор ориентации, n - показатель преломления, (\ (\ text {Q} _ {D} \)) - квантовый выход донора и J интеграл перекрытия. Радиус Ферстера определяет расстояние передачи энергии, поскольку известно, что количественная оценка FRET возможна только в пределах расстояний от \ ((\ frac {1} {2} - 2) \ text {R} _0 \), как также изображено на рис. 2. Подробное описание того, как определить радиус Ферстера, можно найти в FRET — Förster Resonance Energy Transfer Мединца и Хильдебрандта (Meer 2013).

    Рис. 4

    Спектры возбуждения и излучения типичной донорно-акцепторной пары. FRET влияет на интенсивность излучения донора (тушение донора) и интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора). Также показано спектральное перекрытие донорного излучения и спектра возбуждения акцептора.

    Спектры флуоресцентного излучения DCCH и FTSC частично перекрываются, как показано на рис. 7. Следовательно, для получения точного измерения эффективности FRET спектры должны быть спектрально несмешанными.Для этого в спектрометре мы подогнали эмиссионные пики и использовали площадь под пиками как интенсивность подобранного сигнала. Практически это было сделано путем подгонки гауссовых пиков к зарегистрированным спектрам излучения чистого донорного образца (результат \ (\ text {I} _ {D} \)), чистого акцепторного образца (результат \ (\ text {I}) _ {A} \)) и образец, представляющий интерес (в результате были \ (\ text {I} _ {DA} \) и \ (\ text {I} _ {AD} \)), как на рис. 11. Полные параметры подгонки можно найти в дополнительной информации (рисунок S3 и таблица S2).Полученная информация об интенсивности использовалась с уравнениями. 3 и 4, чтобы получить эффективность FRET. Для тушения доноров (уравнение 3) и акцепторной чувствительности (уравнение 4) использовались следующие уравнения.

    $$ \ begin {выровнено} \ eta _ {FRET} = 1 - \ frac {I_ {DA}} {I_D} \ end {выровнено} $$

    (3)

    $$ \ begin {align} \ eta _ {FRET} = \ left (\ frac {I_ {AD}} {I_A} - 1 \ right) \ frac {\ epsilon _A} {\ epsilon _D} \ end { выровнено} $$

    (4)

    \ (\ epsilon _ {A} \) и \ (\ epsilon _ {D} \) - коэффициенты экстинкции акцептора и донора на длине волны возбуждения (Meer 2013; Clegg 1992, 1995).Отношение \ (\ frac {\ epsilon _ {A}} {\ epsilon _ {D}} \) было определено равным 0,02, и его можно найти в дополнительной информации (Таблица S1). Чувствительность акцептора и эмиссия донора схематически изображены на рис. 4.

    FRET с оптической микроскопии

    Бумажные волокна исследовали с использованием установки для широкопольной микроскопии (WM), оснащенной наборами фильтров, показанными в таблице 2. WM работал с Галогенная лампа 50 Вт и КМОП-детектор от QI Imaging (Optimos).

    Таблица 2 Наборы фильтров, используемые для флуоресцентной микроскопии

    Как интенсивность лампы, так и чувствительность детектора показывают зависимость от длины волны и были скорректированы путем расчета поправочных коэффициентов из спектра излучения лампы, сложенного с фильтрами возбуждения, и коэффициентом ослабления. и чувствительность детектора, сложенная с фильтрами излучения и спектрами излучения.Эти поправочные коэффициенты были применены к записанным изображениям, чтобы получить истинное представление об измеренной интенсивности.

    Схематическое изображение окрашенных волокон и пленок pHema можно увидеть на рис. 5. Изображения имеют ложный цвет, чтобы подчеркнуть различия в волокнах / пленках. Образцы исследовались при увеличении в \ (400 \ раз \) для волокон и \ (50 \ раз \) в случае пленок. Чтобы минимизировать фоновый шум, микроскоп использовался в коробке, окруженной черной тканью.

    Рис. 5

    Ложные цветные изображения a, a волоконного соединения и b a pHema пересечения, измеренного с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа. В b показаны также типичные области интереса для алгоритмов Xia. Области выбраны так, чтобы свести к минимуму рассеянный свет от другого волокна / пленки

    При использовании микроскопа используют спектральный диапазон для пространственной информации и теряют преимущество применения этого простого метода подбора, описанного выше.Здесь Гордон и др. Разработали сложный алгоритм, который приводит к полностью скорректированной оценке эффективности FRET. (1998). В методе используются изображения, записанные с помощью трех различных наборов фильтров из Таблицы 2 трех разных образцов. Обычно в результате получается всего девять изображений, но при расположении, показанном на рис.5, можно получить ту же информацию только из трех изображений вместо этого, поскольку на каждом изображении автоматически присутствует чистый донор, чистый акцептор и область FRET. включены.Подробное описание алгоритма см. В исходной статье (Gordon et al. 1998). Вкратце, этот метод вычисляет интенсивность FRET, скорректированную для всех возможных сценариев спектрального просвечивания, в соответствии со следующими уравнениями.

    $$ \ begin {align} {\ overline {Afa}} = \ frac {Af - \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right) Ff} {1 - \ left (\ frac {Fa} { Aa} \ right) \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right)} \ end {align} $$

    (5)

    $$ \ begin {align} FRET1 = \ frac {\ left (Ff - \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) Df - {\ overline {Afa}} \ left [\ left (\ frac {Fa} {Aa} \ right) - \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] \ right)} {G \ left [ 1 - \ left (\ frac {Da} {Fa} \ right) \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ right]} \ end {align} $$

    (6)

    $$ \ begin {align} {\ overline {Dfd}} = Df + FRET1 \ left [1 - G \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] - {\ overline {Afa} } \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ end {align} $$

    (7)

    $$ \ begin {align} FRETN = \ frac {FRET1} {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}} \ end {выравнивается} $$

    (8)

    Уравнения состоят из переменных, состоящих из двух букв.Первая буква обозначает использованный набор фильтров, как показано в таблице 2, вторая буква - исследуемый образец (d = только донор, a = только акцептор, f = область FRET). Например. Следовательно, Af означает область FRET (связанная область), исследованная с помощью набора акцепторных фильтров. Переменные представляют собой измеренные значения интенсивности света из вышеупомянутых изображений микроскопа, записанные как 16-битные значения серого. \ ({\ overline {Afa}} \) относится к сигналу акцептора, который был бы, если бы не присутствовал донор и, следовательно, не возникла FRET.Точно так же \ ({\ overline {Dfd}} \) относится к донорскому сигналу, который был бы, если бы не присутствовал акцептор и, следовательно, не было бы FRET. На изображениях были выбраны интересующие области, как показано на рис. 5b. Оценка производилась по пикселям. G - фактор, связывающий потерю донорного сигнала с увеличением сигнала акцептора (см. Дополнительную информацию в таблице S3). В этой работе мы использовали несколько иной алгоритм Xia et al. который отличается только нормализацией значения \ (\ text {N} _ {\ text {FRET}} \), но в остальном эквивалентен алгоритму Гордона (Xia and Liu 2001).

    $$ \ begin {выровнено} N_ {FRET} = \ frac {FRET1} {\ sqrt {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}}} [-] \ end {выровнено} $$

    (9)

    Рис. 6

    Демонстрация анализа FRET пересечения волокон a, a и b a. В и можно увидеть две типичные проблемы с анализом. Сначала высокий сигнал FRET часто обнаруживался на краях как области склеивания, так и волокон. Во-вторых, сильный ложноположительный сигнал FRET можно увидеть в области, которая явно не может показать FRET.На микроскопическом изображении можно увидеть метод эрозии, использованный для анализа.

    Для возможности воспроизведения области молекулярного контакта был разработан метод, позволяющий всегда выбирать соответствующую область. Метод состоял в том, чтобы вручную нарисовать ROI (интересующую область), захватив «оптически связанную» область на рис. 6. Затем мы применили эрозию изображения, чтобы избежать краев и, таким образом, получить размытую область интереса (рис. 6, нижние изображения), которая затем использовали для оценки интенсивности FRET. Избегать краев было необходимо, потому что области экстремальной интенсивности, по-видимому, дают ложноположительный сигнал FRET.Кроме того, ложные срабатывания также были обнаружены в областях, на которых невозможно отобразить FRET, таких как область, показанная на фиг. 6a, которая не находится в связанной области.

    Другие эксперименты FRET

    Здесь следует упомянуть, что другие эксперименты FRET также использовались. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM, Leica TCS SPE) с фотоумножителем от Hamamatsu был использован для исследования фотообесцвечивания акцептора и сенсибилизированного излучения акцептора в связях волокно-волокно. Идея заключалась в том, что благодаря превосходной настройке будет достигнуто лучшее соотношение сигнал / шум.

    FRET-микроскопия для мониторинга сигнальных событий в живых клетках в реальном времени с помощью мономолекулярных биосенсоров

    1. Установка микроскопа для визуализации FRET

    В принципе, любой инвертированный флуоресцентный микроскоп, имеющийся в лаборатории и имеющий порт для камеры, может быть адаптирован для получения изображений FRET. Окончательная установка должна включать в себя следующие важные компоненты: микроскоп, источник света с дополнительным затвором или без него, светоделитель для эмиссионного света и CCD-камеру (см. Рисунок 1 ).Аппаратные устройства, особенно источник света, затвор и камера, интегрированы и управляются программным обеспечением для обработки изображений, которое позволяет получать и анализировать изображения. Ниже мы описываем процедуру сборки простой системы FRET из имеющихся в продаже компонентов.

    1. Подключите источник света к микроскопу. Например, используйте светоизлучающий диод с одной длиной волны (CoolLED p E-100, 440 нм), который избирательно возбуждает усиленный голубой флуоресцентный белок (CFP), используемый в качестве донора в большинстве биосенсоров FRET.Его можно напрямую и легко подключить к порту эпифлуоресцентной подсветки микроскопа. Также доступны многоволновые светодиоды, которые можно подключать аналогичным образом. Вместо светодиода можно использовать другие стандартные источники света, такие как ксеноновая дуговая лампа XBO75 (часто используемая для микроскопов Olympus и Zeiss) или ртутная лампа HBO (обычно устанавливаемая на микроскопы Nikon). В случае люминесцентной лампы вы также должны поместить заслонку между лампой и портом освещения, чтобы обеспечить программное управление светом возбуждения, попадающим на образец.CoolLED не требует дополнительной шторки, так как ее можно напрямую включать и выключать с помощью программного обеспечения. Недостатком одноцветных светодиодных систем является ограниченное количество длин волн возбуждения, тогда как люминесцентная лампа с различными наборами фильтров является более гибким вариантом, особенно при работе с множественными и бимолекулярными биосенсорами. В качестве альтернативы можно использовать монохроматорные источники света (, например, Polychrome V, TILLPhotonics); они обычно имеют встроенный затвор, которым можно управлять программно с помощью сигнала запуска.
    2. Поместите соответствующий фильтрующий кубик в микроскоп. Для рутинных измерений FRET с CFP и усиленным желтым флуоресцентным белком (YFP) или любым из их вариантов в качестве пары FRET мы используем простой фильтрующий куб, содержащий фильтр возбуждения ET436 / 30M (который можно не использовать при использовании светодиода, но он необходим. при использовании ксеноновой или ртутной лампы вместо светодиодной) и дихроичного зеркала DCLP455. Микроскоп также должен быть оснащен объективом, подходящим для флуоресцентной микроскопии с хорошим разрешением, например, с иммерсионным масляным объективом план-флюор, план-неофлуар или план-апохромат 40x, 60x или 100x.
    3. Включите люминесцентный свет и проверьте, равномерно ли распределено световое пятно в поле зрения. В противном случае требуется дополнительная юстировка светодиода или лампы для достижения оптимального освещения образца. Это можно сделать, используя винты, которые устанавливают диод или лампу в пространстве.
    4. Подключите светоделитель через C-крепление к одному из портов излучения микроскопа. Например, используйте DV2 DualView (Photometrics), который разделяет излучаемый свет на два (донорный и акцепторный) канала, которые можно одновременно контролировать на одной микросхеме камеры CCD.В качестве альтернативы есть другие сопоставимые продукты, такие как Optosplit (Cairn Research) или светоделитель, интегрированный в двухволновую камеру Hamamatsu ORCA-D2. Для пары CFP / YFP FRET мы используем набор фильтров 05-EM, содержащий дихроичное зеркало 505dcxr плюс эмиссионные фильтры ET480 / 30M и ET535 / 40M для CFP и YFP, соответственно, которые поставляются с DV2. Вместо светоделителя два фильтрующих куба для донора (содержащие фильтр возбуждения ET436 / 30M для CFP, дихроичное зеркало DCLP455 и эмиссионный фильтр CFP) и акцептор (содержащий фильтр возбуждения CFP, DCLP455 и эмиссионный фильтр YFP) каналы используются во многих системах FRET.В качестве альтернативы можно установить один фильтрующий куб без какого-либо эмиссионного фильтра и положение колеса автоматического эмиссионного фильтра перед установкой камеры. В этом случае моторизованный микроскоп или колесо фильтров переключаются между двумя положениями эмиссионного фильтра в течение ~ 200-300 мсек для выполнения логометрического изображения. Эта небольшая задержка приемлема при визуализации довольно медленных внутриклеточных процессов, таких как сигналы цАМФ, когда действительно одновременное получение обоих каналов не критично.
    5. Подключите камеру CCD (используйте, например, ORCA-03G или ORCA-R2 от Hamamatsu Photonics) к светоделителю.Используйте кабель FireWire для подключения камеры к компьютерному интерфейсу IEEE1394, как описано в руководстве, прилагаемом к камере. Установите драйверы камеры, не включая камеру.
    6. Наконец, чтобы установить связь между компьютером и источником света, подключите плату ввода-вывода Arduino (используйте, например, Arduino Duemilanove или Arduino Uno) к светодиоду или шторке с помощью кабеля BNC, который должен содержать обычный BNC. Подключите вилку со стороны светодиода и два одиночных провода на другом конце, подключенные к контактам GND (0) и 8 платы, как показано на Рис. 2 .Собранная плата может быть напрямую подключена к USB-порту вашего компьютера.

    2. Настройка программного обеспечения для обработки изображений

    Для управления и синхронизации источника света с захватом изображения камерой на компьютере должно быть установлено программное обеспечение для обработки изображений. Существует несколько коммерчески доступных программных пакетов, включая MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Visitron Systems). Здесь мы демонстрируем использование бесплатного программного обеспечения Micro-Manager с открытым исходным кодом, которое обеспечивает высокую степень гибкости для недорогой обработки изображений.

    1. Загрузите это программное обеспечение с http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/index.php/Micro-Manager_Version_Archive. Мы рекомендуем установить версию 1.4.5, которую легко настроить в наших руках.
    2. Подключите плату Arduino к USB-порту вашего компьютера. Загрузите программное обеспечение для управления платой Arduino с http://www.arduino.cc/en/Main/software. Следуйте инструкциям на этом веб-сайте и запустите это программное обеспечение только один раз перед запуском Micro-Manager. Загрузите код для использования платы с программным обеспечением Micro-Manager.Код можно скачать по адресу http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/index.php/Arduino.
    3. Включить светодиод и камеру. Запустите программное обеспечение и настройте связь Micro-Manager с камерой и светодиодом (другим источником света и затвором), выбрав Инструменты> Мастер настройки оборудования (см. , рис. 3, ). Добавьте необходимые компоненты, включая камеру (, например, Hamamatsu_ DCAM ) и плату Arduino (добавьте Arduino-Switch , Arduino-Hub и Arduino-Shutter ).На следующих шагах используйте настройки по умолчанию, предложенные мастером. По запросу мастера сохраните новую конфигурацию системы.
    4. Используйте главное меню, чтобы открыть Инструменты> Обозреватель свойств устройства. Прокрутите вниз до «Arduino Switch State» и выберите «1». Закройте диалог. Убедитесь, что в главном диалоговом окне программы установлен флажок «Автозатвор». Нажмите «Файл»> «Сохранить состояние системы», чтобы сохранить конфигурацию программного обеспечения, которая должна быть открыта в любое время после запуска программного обеспечения. Это установит связь между платой и программным обеспечением, необходимым для получения изображения.
    5. Нажмите кнопку «Live», чтобы контролировать сигнал, поступающий с камеры. Убедитесь, что флуоресцентный свет включается каждый раз, когда выбирается функция «Live» или «Snap». Перед началом первых измерений следуйте инструкциям, прилагаемым к светоделителю, чтобы выполнить оптическую настройку обоих каналов.

    3. Культура клеток и трансфекции

    1. Подготовьте 6-луночные планшеты с автоклавированными круглыми стеклянными покровными стеклами 24 мм (1 покровное стекло на лунку). В качестве альтернативы можно использовать чашки для культивирования клеток со стеклянным дном.
    2. Поместите клетки 293A на планшеты или чашки в среде D-MEM (с добавлением 10% FCS, 1% L-глутамина и 1% раствора пенициллина / стрептомицина) так, чтобы клетки достигли 50-70% слияния через один день.
    3. Через 24 часа после посева трансфицировать клетки в лабораторном стенде с ламинарным потоком сенсорной плазмидой FRET, используя метод трансфекции фосфатом кальция (см. 3.5). Плазмиды биосенсора цАМФ могут быть получены от нашей группы по запросу. Читателя также отсылают к исчерпывающим обзорам 7,8 , в которых описаны другие доступные биосенсоры цАМФ.
    4. Перед первой трансфекцией клеток приготовьте реагенты для трансфекции. Приготовьте 2,5 М растворы CaCl 2 и 2xBBS (последний содержит 1,5 мМ Na 2 HPO 4 , 50 мМ BES, 280 мМ NaCl, довести pH до 6,95 с помощью NaOH) в деионизированной воде. Стерильно фильтруйте растворы, используя обычный фильтр 0,2 мкм.
    5. Чтобы трансфицировать 6-луночный планшет или 6 чашек со стеклянным дном, смешайте 10 мкг сенсорной плазмиды FRET, 50 мкл 2,5 М раствора CaCl 2 и стерильную воду до 500 мкл.Хорошо смешать.
    6. Добавьте 500 мкл 2x BBS. Хорошо перемешайте и инкубируйте смесь 10 мин при комнатной температуре.
    7. Внесите по каплям 165 мкл трансфекционной смеси в каждую лунку или чашку. Аккуратно перемешайте планшет и снова поместите его в инкубатор. Клетки обычно готовы к измерениям FRET через 24 часа после трансфекции. Убедитесь, что на этом этапе клетки не достигли слияния, так как это может повлиять на активность нескольких рецепторов на поверхности клетки.

    4. Измерения FRET в живых клетках

    1. Перед первым измерением подготовьте буфер FRET, содержащий 144 мМ NaCl, 5.4 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2 , 2 мМ CaCl 2 , 10 мМ HEPES в деионизированной воде и довести pH до 7,3 с помощью NaOH. Разбавьте соединения, которые будут использоваться в ваших экспериментах по визуализации, с буфером FRET.
    2. Запустите программу обработки изображений. Загрузите ранее определенную конфигурацию системы. Выберите «Файл»> «Загрузить состояние системы», чтобы выбрать ранее настроенное состояние системы.
    3. Установите покровное стекло с прилипшими трансфицированными клетками 293A в камеру для визуализации (, например, камера для клеток Attofluor).Промойте клетки один раз буфером FRET и добавьте 400 мкл буфера FRET. При использовании чашек для культивирования клеток со стеклянным дном промойте прилипшие клетки и добавьте 2 мл буфера на чашку. Мы проводим все измерения при комнатной температуре в буфере FRET, содержащем HEPES, поэтому контроль CO 2 не требуется.
    4. Нанесите немного иммерсионного масла на объектив и перенесите камеру формирования изображений на микроскоп. Сфокусируйтесь на клеточном слое, используя просвечивающий свет.
    5. Включите люминесцентный свет, нажав кнопку «Live», и выберите ячейку для эксперимента.Выберите ячейку с оптимальным выражением сенсора, что означает, что она не должна быть слишком яркой и не слишком тусклой. Найдя подходящую ячейку, немедленно выключите флуоресцентный свет, чтобы избежать фотообесцвечивания датчика FRET.
    6. Отрегулируйте время экспозиции в «Настройках камеры» (обычно 10-50 мсек) таким образом, чтобы обеспечить хорошее соотношение сигнал / шум полученного изображения после нажатия кнопки «Snap». Слишком долгое время возбуждения может привести к фотообесцвечиванию, а слишком короткое - к низкому качеству изображения.
    7. Нажмите кнопку "Multi-D Acq." и установите количество временных точек и временной интервал для получения изображения. Для нашего датчика cAMP-FRET мы получаем одно изображение каждые 5 секунд.
    8. Начните измерения, нажав кнопку «Получить».
    9. Во время любого измерения можно использовать подключаемый модуль «FRET online» (доступен в онлайн-приложении , все подключаемые модули должны быть скопированы в папку «plugins» программного обеспечения Micro-Manager перед его запуском) для мониторинга Коэффициент FRET изменяется онлайн.Запустите этот плагин и выберите интересующую область на изображении с соотношением FRET, используя инструмент «Произвольное выделение». Добавьте регион в менеджер ROI и нажмите кнопку «Получить среднее» в окне «Анализатор временных рядов». Отобразится график соотношения FRET. Чтобы обновить график во время измерения, запустите плагин «FRETratioOnline2» и нажмите кнопку «GetAverage».
    10. Как только соотношение FRET достигнет стабильной базовой линии, нанесите желаемое соединение, аккуратно нанеся его пипеткой в ​​чашку / камеру.Для обработки клеток фармакологическими соединениями на этом этапе можно использовать перфузионную систему вместо простого пипетирования.
    11. После завершения эксперимента сохраните стопку покадровых изображений. Снимите измерительную камеру с микроскопа и очистите объектив тканью для объектива.
    12. Вернитесь к шагу 4.3, чтобы повторить измерение с новым образцом.

    5. Анализ данных в автономном режиме

    Данные визуализации

    FRET можно анализировать в автономном режиме в любое время после эксперимента с помощью программного обеспечения ImageJ.В качестве дополнения к этому протоколу мы предоставляем плагин «FREToffline», используемый в нашей лаборатории для разделения полученных изображений на донорные и акцепторные каналы и для измерения интенсивности флуоресценции в нескольких областях, представляющих интерес. Эти значения интенсивности можно в дальнейшем скопировать в электронную таблицу Excel или Origin для расчета скорректированного отношения FRET. Для визуализации изменений FRET мономолекулярных биосенсоров часто используется простая ратиометрия. В этом случае возбуждается только донорный флуорофор (CFP), и делаются два изображения с пиками эмиссии CFP и YFP.Вычисленное соотношение YFP ​​/ CFP (иногда также называемое соотношением FRET / CFP) представляет собой степень FRET между двумя флуорофорами. В мономолекулярных биосенсорах количество фрагментов CFP и YFP одинаково, так что простой ратиометрии достаточно для представления эффективности FRET 12 .

    1. Используйте программу ImageJ, чтобы открыть файл эксперимента, выбрав Плагины> Микро-менеджер> Открыть файл микро-менеджера.
    2. Запустите подключаемый модуль "FREToffline", который разбивает стек покадровой съемки на отдельные каналы CFP и YFP.
    3. Если требуется коррекция фона, это можно выполнить с помощью программного обеспечения ImageJ.
    4. Щелкните стопку изображений YFP, выберите одну или несколько областей интереса с помощью инструмента «Произвольное выделение» и добавьте их в окно плагина «MultiMeasure», нажав кнопку «Добавить».
    5. Выберите интересующие области в окне «MultiMeasure» и нажмите «Multi», чтобы получить таблицу со средними значениями серого для каждого кадра и каждой области. Скопируйте данные в буфер обмена, выделив все с помощью Ctrl + A и нажав Ctrl + C.Откройте электронную таблицу Excel или Origin и вставьте данные, нажав Ctrl + V.
      Измерения, выполняемые программой, можно настроить в разделе «Анализ»> «Установить измерения», где вы можете определить параметры для измерения. Обычно в этом диалоге мы выбираем только «Среднее значение серого».
    6. Щелкните по стопке изображений CFP. Выполните то же, что описано в 5.5. Вставьте данные об интенсивности CFP в ту же таблицу Excel или Origin.
    7. С помощью программного обеспечения Excel или Origin рассчитайте скорректированный коэффициент FRET.Когда визуализируются простые одноцепочечные мономолекулярные биосенсоры, мы корректируем только перетекание донорной флуоресценции в акцепторный канал. В этом случае скорректированное соотношение акцептор / донор составляет:
      Отношение = (YFP - B x CFP) / CFP
      , где B - поправочный коэффициент, который может быть определен путем трансфекции клеток плазмидой CFP и измерения процента флуоресценции донора в канал YFP (B = YFP / CFP). Пропуск этой поправки для мономолекулярных биосенсоров возможен, поскольку это повлияет только на общую амплитуду ответа FRET без какого-либо качественного влияния на форму кривой.

    6. Представитель Результаты

    На рис. 1 показан пример полностью собранной установки для визуализации FRET, состоящей из инвертированного микроскопа Nikon, CoolLED, DV2 DualView и камеры Hamamatsu ORCA-03G CCD. Чтобы установить связь между аппаратными компонентами и компьютером, плата ввода-вывода Arduino подключается к компьютеру и к CoolLED, как показано на Рис. 2 . Для синхронного управления источником света и захвата изображения камерой необходимо установить и правильно настроить программное обеспечение Micro-Manager (см. , рис. 3, ).Это бесплатное программное обеспечение можно легко адаптировать к индивидуальным экспериментальным потребностям, добавив необходимые плагины. Фигура 4A показывает репрезентативную необработанную кривую отношения FRET из измерения с использованием датчика цАМФ Epac1-camps 13 , экспрессированного в клетках 293A, для мониторинга эффектов β-адренергического агониста изопротеренола, применяемого в момент времени 150 с, и β-блокатора пропранолола. добавлен в момент времени 300 секунд (выполняется, как описано в 4.3-4.10). Эти данные могут быть проанализированы в автономном режиме и скорректированы на просачивание CFP в канал YFP, как описано в 5.1-5.7, чтобы получить скорректированный график отношения FRET, показанный на рис. 4B . Этот репрезентативный эксперимент показывает медленное снижение отслеживаемого отношения FRET после обработки изопротеренолом, что указывает на увеличение внутриклеточного цАМФ. Пропранолол как β-блокатор обращает сигнал изопротеренола, что приводит к снижению цАМФ до базального уровня. Эти изменения в сигнале FRET можно отслеживать в режиме онлайн во время любых экспериментов (как описано в 4.9). Такие эксперименты можно проводить с помощью множества широко используемых биосенсоров, предназначенных для мониторинга различных вторичных мессенджеров или биохимических процессов.


    Рис. 1. Схема установки FRET для визуализации, состоящая из CoolLED, инвертированного микроскопа Nikon, DV2 DualView и камеры ORCA-03G CCD.


    Рисунок 2. Плата ввода-вывода Arduino и ее соединения. Плата помещена в самонастраивающийся пластиковый ящик. Стандартный кабель BNC соединяет светодиод с контактами 8 и GND (0) платы.


    Рисунок 3. Скриншоты, демонстрирующие интеграцию компонентов системы с помощью мастера настройки оборудования. A ) Запустите мастер настройки оборудования. B ) Добавьте необходимые устройства, как указано в 2.3. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.


    Фигура 4. Репрезентативный эксперимент FRET, который измеряет уровни цАМФ в клетках 293A, трансфицированных Epac1-camps. Сначала клетки стимулировали β-адренергическим агонистом изопротеренолом (100 нМ, на 30-й рамке или 150 с) для увеличения цАМФ (наблюдаемого как уменьшение отношения YFP / CFP FRET). Затем клетки обрабатывали β-блокатором пропранололом (10 мкМ, на 60 кадре или 300 с), что приводит к увеличению отношения FRET, отражающему снижение цАМФ. A ) Необработанная кривая отношения FRET в режиме онлайн из одной интересующей области, соответствующей отдельной клетке, отслеживаемой во время эксперимента. B ) Скорректированная кривая отношения после автономного анализа данных, выполненного, как описано в 5.1-5.7.

    Требуется подписка. Пожалуйста, порекомендуйте JoVE своему библиотекарю.

    20 браслетов Austin, которые стоит посмотреть в 2018 году

    Остин более чем зарекомендовал себя как творческий центр для новых и уже существующих групп. Гэри Кларк-младший, Шейки Грейвс, Эфраим Оуэнс и Мидленд - это лишь некоторые из тех, кто считает столицу живой музыки своим домом.

    Некоммерческая организация Black Fret обеспечивает дополнительную поддержку и наглядность процветающей музыкальной сцены в Остине. Основанная в январе 2013 года, Black Fret номинирует и предоставляет гранты остинским музыкантам посредством голосования членов.

    Уже четвертый год Black Fret только что вручил гранты своим номинантам на бал Black Fret Ball в 2017 году. Праздник прошел в Paramount Theater, где выступил весь класс номинантов 2017 года. Гранты в размере 18 000 долларов были предоставлены десяти номинантам: Джеки Венсон, Уоррен Худ, Сара Шарп, Кэролайн Уандерленд, Bright Light Social Hour, Whisky Shivers, Эрик Тессмер, Олень, Мобли и Леопольд и его произведения.

    грантов в размере 5 500 долларов США получили оставшиеся десять номинантов: Акина Аддерли, Cowboy Diplomacy, Croy & the Boys, Daniel Eyes, David Ramirez, Greyhounds, Jane Ellen Bryant, Kinky Machine и Los Coast. Оставшийся кандидат, Black Pistol Fire, решил исключить себя из рассмотрения из-за удачного года и попросил Black Fret выделить средства гранта для распределения среди других незначительных получателей гранта.

    Culture Collide не новичок на музыкальной сцене Остина, проводя ежегодные мероприятия во время SXSW и на аванпосте Collide ATX с участием местных групп и ди-джеев.В приведенном ниже списке перечислены действия, которые мы слышали, видели или заметили на нашем радаре - и они должны быть в вашем списке. Многие группы уже сами по себе добиваются успеха на национальном и международном уровнях (в первую очередь это Whiskey Shivers, появившиеся в последнем Pitch Perfect 3).

    С учетом сказанного, вот 20 групп Austin, которые стоит посмотреть в 2018 году:


    Акина Аддерлей

    Душевная певица Акина Аддерли происходит от певцов.Ее отец, Нат Аддерли-младший, был джазовым пианистом и бывшим руководителем оркестра Лютера Вандросса, а ее дед и дедушка были известными джазовыми музыкантами Нат Аддерли и Джулиан «Пушечное ядро» Аддерли. Вдохновляясь этим, она создает звук и стиль, полностью совпадающий с джазом, роком и сладкой соул-музыкой.


    Черный пистолет Огонь

    Black Pistol Fire - это высокооктановый рок с элементами блюза и R&B. Их зажигательные живые выступления обеспечили им места на фестивалях Lollapalooza, Austin City Limits, Bonnaroo, Sasquatch Music Festival, Shaky Knees, Governor’s Ball и многих других.


    The Bright Light Social Hour

    Мелодичный психоделический рок, Bright Light Social Hour выпустили свой дебютный полноформатный альбом в 2011 году и получили шесть наград, в том числе «Группа года», «Альбом года» и «Песня года» на Austin Music Awards 2011. Они также играли в Lollapalooza, Austin City Limits и выступали для Aerosmith в Plains of Abraham в Квебеке. В 2015 году они выпустили второй полноформатный альбом Space Is Still The Place .


    Каролин Страна чудес

    Известная американская блюзовая певица, автор песен и гитарист Кэролин Страна чудес овладела искусством пения с душой и остроумием. За свою многолетнюю карьеру она сотрудничала с бесчисленным количеством артистов и выступала на Austin City Limits Live с Шэрон Джонс и Dap Kings.


    Ковбойская дипломатия

    Эта южная рок-группа вчетвером во главе с фронтменом Яном Кокраном быстро завоевала признание за небольшой промежуток времени благодаря характерному рычащему вокалу Яна, их задушевному блюзовому звучанию и умелому написанию песен. Cowboy Diplomacy был признан лучшей группой в выпуске Austin Monthly's Best of ATX 2017, занял второе место в номинации «Лучшая новая группа Остина» на Austin Music Awards 2017, а также разогревался для «Тысячи лошадей».


    Крой и мальчики

    Укоренившись в деревне, Croy and the Boys сочиняют необычные и восхитительные южные рок-мелодии о своем жизненном опыте. Они приглашают слушателей присоединиться к ним в их путешествии. Группа была официальным артистом, участвовавшим в шоу SXSW в 2016 году, и играла культовую «Pappy + Harriet’s».


    Дэниел Глаза

    Певец / автор песен Daniel Eyes выделяется своим свежим музыкальным подходом, который отсылает к классическому року, как это было слышно в его группе Daniel Eyes & the Vibes, дебютном EP Sweet Dreaming, выпущенном в январе 2016 года. Austin Chronicle приветствовала их «Чванство больше, чем сцена, разгрузка энергии бездельника панка с мелодиями, которые отскакивают между Dire Straits и Police восьмидесятых, и грубой гаражной гитарой Курта Вайла.На фестивале SXSW 2016 группа получила 2 место в рейтинге «Лучшая новая группа Остина» и 3 место в номинации «Лучшая рок-группа с исполнением» в Austin Chronicle Music Awards.


    Дэвид Рамирес

    Покорив сердца своим честным сочинением песен и трогательным вокалом, Дэвид Рамирес только что выпустил свою последнюю прекрасную работу - We’re Not Going Anywhere 2017 года. Сострадательный и политический альбом был вдохновлен текущим климатом и новостным циклом, а также противостоянием ненависти и дискриминации.Он одинаково успокаивает и бодрит, и его нужно обязательно слушать.


    Эрик Тессмер

    Монстр гитариста и певца / автора песен Эрик Тессмер , неизменно завораживает публику своими живыми выступлениями, в которых его энергичная и точная игра на гитаре находится в центре внимания. Тессмер пленил толпу на таких фестивалях, как Montreal Jazz Fest, Summerfest и MusikFest, а также выступал на одной сцене с Диком Дейлом, Гэри Кларком-младшим и другими.


    Борзые

    Этот фанковый дуэт состоит из гитариста Эндрю Трубе и клавишника Энтони Фаррелла.Вместе они создают свое собственное звучание, которое было описано как «Hall & Oats встречает ZZ Top». Greyhounds выпустили три альбома на лейбле Memphis’s Ardent Records и в настоящее время работают над новым полноформатным альбомом 2018 года.


    Джеки Венсон

    Этот задушевный певец может за доли секунды отправиться в город на гитаре. Джеки Венсон сырой, грубый и яркий звук, сочетающий блюз, рок и R&B с вдумчивыми текстами, которые производят впечатление.Ее третий студийный релиз, Transcends EP, уже вышел.


    Джейн Эллен Брайант

    Певица / автор песен и гитарист Джейн Эллен Брайант пишет откровенные песни, которые могут понравиться каждому, исполненные с размахом и впечатляющим вокальным диапазоном. 2017 год оказался для нее самым крупным. В феврале Брайант выпустила свой популярный сингл All in My Head. В марте она была официальным представителем SXSW, выступая на сцене Pandora SXSW, и получила награды «Лучшая новая группа» и «Лучшая вокалистка» на Austin Music Awards 2017.


    Странная машина

    Постмодернистские гаражные рокеры Kinky Machine поднимают DIY-сцену на новый уровень своими жесткими гимнами. Они были представлены в Good Music Club, серии концертов, куратором которой является Лори Галлардо из KUTX.


    Леопольд и его художественная литература

    Leopold and His Fiction создали уникальное звучание, сочетающее гаражный панк и поп-музыку Motown / R&B. Группа выпустила свой четвертый полноформатный альбом Darling Destroyer в начале этого года.Альбом воплощает в себе острый, но душевный звук: «Песни говорили мне:« Это то, из чего вы сделаны, так что поверьте », - говорит фронтмен Дэниел Леопольд.


    Лос-Кост

    Los Coast включает певца Трея Привотта и клавишника и гитариста Джона Кортни, а завершается Меган Хартман на басу, Дэмиеном Лланесом на ударной установке и Нэтом Райт на клавишах. Как единое целое, Los Coast создает энергичные, эмоциональные песни. Группа планирует выпустить свой дебютный альбом в 2018 году на лейбле New West Records.


    Мобли

    Персональное шоу Мобли пишет, продюсирует и исполняет всю свою музыку, включая все инструменты. Его живое шоу состоит из перехода артиста от клавишных и синтезаторных пэдов к барабанам, гитаре и обратно. Он остается хладнокровным на протяжении всего этого, ни разу не нарушив пота или не сконцентрировавшись. Скорее всего, вы слышали голос Мобли. Он сочинил десятки пьес для сцены и телевидения (с размещением на HBO, ESPN, Fox и NBC), поделился сценами с Phantogram, JUNGLE, Mutemath, Robert Delong, & Wavves и играл на ACL, SXSW, CMJ и других.


    Сара Шарп

    Джазовая певица и автор песен Сара Шарп имеет международную репутацию благодаря своему проникновенному пению и текстам. Она была удостоена награды «Лучшая вокалистка», «Продюсер», «Автор песен», «Альбом года», «Песня года», «Группа года» и «Лучшая джазовая группа» на церемонии вручения премии Austin Music Awards 2014, а также была представлена ​​в программе «Путешествие песни» NPR с Майклом Файнштейном. Ее песни были представлены в рекламных кампаниях Chanel, Dell, «The Good Wife» и других.


    Олень

    Описанный как трансцендентный техасский фолк и звездный серф-вестерн, The Deer создает психотропные звуковые ландшафты и спокойный, яркий поп-музыку. The Deer играли Керрвильский фольклорный фестиваль, Музыкальный фестиваль старых поселенцев, Utopiafest и Орегонскую ярмарку. В 2016 году они выпустили свой второкурсник полноформатный Tempest & Rapture .


    Уоррен Худ

    Музыкант, композитор и певец Уоррен Худ начал свою карьеру в одиннадцать лет, когда впервые взял в руки скрипку.С тех пор он добавил в свой список скрипку и мандолину. Он получил редкую стипендию в музыкальном колледже Беркли, где специализировался на скрипке, играл со Стивеном Тайлером и получил желанную премию за достижения в области струнных инструментов.


    Виски Shivers

    Если вы встретите полосу босоногого мятлика, скорее всего, это Whisky Shivers . Эти парни любят хорошо проводить время, и их позитивный настрой заразителен, как и их искрометный фолк-рок.Бобби Фицджеральд идет впереди, весело играя на скрипке и поет. Их четвертый полнометражный альбом Some Part of Something уже вышел. Ищите группу на большом экране в Pitch Perfect 3.

    фото: любезно предоставлено художниками

    .