25Авг

Чем обусловлена многофункциональность молекул белка: Чем обусловлена многофункциональность молекул белка?

Содержание

Строение и функции белков — конспект

  
Вернуться к теме «Строение и функции белков»

Белки – полимеры, мономерами которых являются аминокислоты.

Среди органических веществ белки занимают первое место по количеству и по значению. В организме человека встречаются 5 млн разнообразных белковых молекул, отличающихся не только друг от друга, но и от белков других организмов. Несмотря на такое разнообразие и сложность строения они построены всего из 20 различных аминокислот.

Строение аминокислоты:

 

В левой части молекулы расположены группа h3N–, которая обладает свойствами основания; справа — группа –COOH — кислотная, характерная для всех органических кислот. Следовательно, аминокислоты – амфотерные соединения, совмещающие свойства и кислоты и основания. Этим обусловлена их способность взаимодействовать друг с другом. Соединяясь, молекулы аминокислот образуют связи между углеродом кислотной и азотом основной групп. Такие связи называются ковалентными, а в данном случае –

пептидными связями:

Соединение двух аминокислот в одну молекулу называется дипептидом, трех аминокислот – трипептидом и т. д., а соединение, состоящее из 20 и более аминокислотных остатков, – полипептидом.

Последовательность аминокислот в полипептидной цепи принято называть первичной структурой белка.

Однако молекула белка в виде цепи аминокислотных остатков, последовательно соединенных между собой пептидными связями, еще не способна выполнять специфические функции. Для этого необходима более высокая структурная организация. Путем образования водородных связей между остатками карбоксильных и аминогрупп разных аминокислот белковая молекула принимает вид спирали (α-структура) или складчатого слоя – «гармошки» (β-структура). Это вторичная структура белка. Но и ее часто недостаточно для приобретения характерной биологической активности.

Часто только молекула, обладающая третичной структурой, может выполнять роль катализатора или любую другую. Третичная структура образуется благодаря взаимодействию радикалов, в частности радикалов аминокислоты цистеина, которые содержат серу. Атомы серы двух аминокислот, находящихся на некотором расстоянии друг от друга в полипептидной цепи, соединяются, образуя так называемые дисульфидные, или S–S, связи. Благодаря этим взаимодействиям, а также другим, менее сильным связям, белковая спираль сворачивается и приобретает форму шарика, или глобулы. Способ укладки полипептидных спиралей в глобуле называют третичной структурой белка. Многие белки, обладающие третичной структурой, могут выполнять свою биологическую роль в клетке. Однако для осуществления некоторых функций организма требуется участие белков с еще более высоким уровнем организации.

Такую организацию называют

четвертичной структурой. Присутствует не у всех белков. Она представляет собой функциональное объединение нескольких (двух, трех и более) молекул белка, обладающих третичной структурной организацией. Пример такого сложного белка – гемоглобин. Его молекула состоит из четырех связанных между собой молекул. Другим примером может служить гормон поджелудочной железы – инсулин, включающий два компонента. В состав четвертичной структуры некоторых белков включаются помимо белковых субъединиц и разнообразные небелковые компоненты. Тот же гемоглобин содержит сложное гетероциклическое соединение, в состав которого входит железо.

Строение белковой молекулы: А – первичная; Б – вторичная; В – третичная; Г – четвертичная структура

Строение молекулы гемоглобина

Гемоглобин – белок четвертичной структуры. В молекуле гемоглобина белковый компонент представлен белком глобином, небелковый компонент – гем. Глобин состоит из 4 субъединиц. Внутри каждой субъединицы имеется гидрофобный «карман», в котором располагается гем. Содержащийся в геме атом железа связывает кислород.

Свойства белка

Белки, как и другие неорганические и органические соединения, обладают рядом физико-химических свойств:

  1. Белки – преимущественно водорастворимые молекулы и, следовательно, могут проявлять свою функциональную активность только в водных растворах.
  2. Белковые молекулы несут большой поверхностный заряд. Это определяет целый ряд электрохимических эффектов, например изменение проницаемости мембран каталитической активности и других функций.
  3. Белки термолабильны, то есть проявляют свою активность в узких температурных рамках.

Денатурация и ренатурация белков

Денатурация  – это утрата белковой молекулой своей структурной организации: четвертичной, третичной, вторичной, а при более жестких условиях – и первичной структуры. В результате денатурации белок теряет способность выполнять свою функцию. Причинами денатурации могут быть высокая температура, ультрафиолетовое излучение, действие сильных кислот и щелочей, тяжелых металлов и органических растворителей. Если изменение условий среды не приводит к разрушению первичной структуры молекулы, то при восстановлении нормальных условий среды полностью воссоздается структура белка и его функциональная активность. Такой процесс носит название

ренатурации.

Функции белков

1. Каталитическая (ферментативная) функция:

Многие белки являются ферментами. Ферменты — это биологические катализаторы, т. е. вещества, ускоряющие протекание химических реакций в живых организмах. Ферменты участвуют в процессах синтеза и расщепления различных веществ. Они обеспечивают фиксацию углерода в процессе фотосинтеза, расщепление питательных веществ в пищеварительном тракте и т. д. 

 

2. Транспортная функция

Многие белки способны присоединять и переносить различные вещества. Гемоглобин связывает и переносит кислород и углекислый газ. Альбумины крови транспортируют жирные кислоты, глобулины — ионы металлов и гормоны. Многие белки, входящие в состав цитоплазматической мембраны, участвуют в транспорте веществ в клетку и из нее.

3. Защитная функция

Белки предохраняют организм от вторжения чужеродных организмов и от повреждений. Так, в ответ на проникновение чужеродных объектов (антигенов) определенные лейкоциты вырабатывают специфические белки — иммуноглобулины (антитела), участвующие в иммунном ответе организма. Белок плазмы крови фибриноген, участвуя в свертывании крови и тем самым уменьшая кровопотери.

4. Двигательная (сократительная) функция

Сократительные белки обеспечивают способность клеток, тканей, органов и целых организмов изменять форму, двигаться. Так, актин и миозин обеспечивают работу мышц и немышечные внутриклеточные сокращения.

5. Структурная (строительная, пластическая) функция

Белки входят в состав всех клеток и тканей живых организмов. Белки являются обязательным компонентом всех клеточных мембран и органоидов клетки. Из белков построены элементы цитоскелета, сократительные элементы мышечных волокон. Преимущественно из белков состоят хрящи и сухожилия. В их состав входит белок коллаген. Важнейшим структурным компонентом перьев, волос, ногтей, когтей, рогов, копыт у животных является белок кератин. В состав связок, стенок артерий и лёгких входит структурный белок эластин.

6. Сигнальная (рецепторная) функция

Некоторые белки клеточных мембран способны изменять свою структуру в ответ на действие внешних факторов. С помощью этих белков происходит прием сигналов из внешней среды и передача информации в клетку.

7. Регуляторная функция

Некоторые белки являются гормонами. Они влияют на различные физиологические процессы. Например, инсулин и глюкагон регулируют содержание глюкозы в крови, а соматотропин (гормон роста) — процессы роста и физического развития.

8. Запасающая (питательная) функция

В семенах растений запасаются резервные белки, которые используются при прорастании зародышем.

9. Энергетическая функция

При полном окислении 1 г белка выделяется 17,6 кДж энергии. Однако белки расходуются на энергетические нужды лишь в крайних случаях, когда исчерпаны запасы углеводов и жиров.

— свойства белков — Биохимия

К физико-химическим свойствам белков относят амфотерность, растворимость, способность к денатурации, коллоидные свойства.

Амфотерность

Так как белки содержат кислые и основные аминокислоты, то в их составе всегда имеются свободные кислые (СОО

–) и  основные (NH3+) группы.

Заряд белка зависит от соотношения количества кислых и основных аминокислот. Поэтому, аналогично аминокислотам, белки заряжаются положительно при уменьшении рН, и отрицательно при его увеличении. Если рН раствора соответствует изоэлектрической точке белка, то заряд белка равен 0.

Если в пептиде или белке преобладают основные аминокислоты (лизин и аргинин), то при нейтральных рН заряд белка положительный, т.к. обусловлен положительным зарядом радикала этих аминокислот.

Если в белке преобладают кислые аминокислоты (глутамат и аспартат), то белок кислый, при нейтральных рН заряд белка отрицательный и изоэлектрическая точка находится в кислой среде. Для большинства природных белков изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН 4,8-5,4, что свидетельствует о преобладании в их составе глутаминовой и аспарагиновой аминокислот.

Амфотерность имеет значение для выполнения белками некоторых функций. Например, буферные свойства белков, т.е. способность поддерживать стабильность рН крови, основаны на способности присоединять ионы Н+ при закислении среды или отдавать их при защелачивании.

С практической стороны наличие амфотерности позволяет разделять белки по заряду (электрофорез) или использовать изменение величины рН раствора для осаждения какого-либо известного белка. Наличие как положительных, так и отрицательных зарядов в белке обусловливает их способность к высаливанию, что удобно для выделения белков в нативной (живой) конформации.

Влияние рН на заряд белка

При смещении рН в растворе изменяется концентрация ионов Н+. При закислении среды (при снижении рН) ниже изоэлектрической точки ионы Н+ присоединяются к отрицательно заряженным группам глутаминовой и аспарагиновой кислот и нейтрализуют их. Заряд белка при этом становится положительным.

При увеличении рН в растворе выше изоэлектрической точки концентрация ионов Н+ снижается и положительно заряженные группы белка (NH3+-группы лизина и аргинина) теряют протоны, их заряд исчезает. Суммарный заряд белка становится отрицательным.

Изменение заряда белковой цепи при изменении pH

Растворимость

Так как большинство белков несет много заряженных групп, то в целом они водорастворимы. Растворимость объясняется:

  • наличием заряда и взаимоотталкиванием заряженных молекул белка,
  • наличием гидратной оболочки – окружение молекулы диполями воды и взаимодействие их с полярными и заряженными группами на поверхности глобулы белка. Чем больше полярных и/или заряженных аминокислот в белке, тем больше гидратная оболочка.

Например, 100 г белка альбумина связывает 30-50 г воды.

 

Какие функции выполняет белок в организме человека – блог justfood

Роль белков для организма человека

Для начала следует пояснить: все живое во Вселенной состоит из протеина (он же – белок). Не просто так, пытаясь обнаружить признаки жизни где-то еще, кроме Земли, ученые в первую очередь ищут молекулы воды и белка. Именно белок в составе организмов свидетельствует о том, что они живые.

Одним словом, белки – это основа жизни. Проникая внутрь вместе с едой, он проходит длинный и удивительный процесс всевозможных преобразований: последовательное расщепление на полипептиды и олигопептиды, а уже в конце мы получаем давно знакомые нам аминокислоты.

Ещё недавно ученые знали о 150 видах аминокислот, но ежегодно их перечень растёт. Вариации столь неповторимы и разнообразны, что в нашем теле невозможно найти две идентичных молекулы.

Белки – основополагающий стройматериал для женского тела. Они сохраняют упругость и здоровье кожи, ногтей и волос. Вдобавок, белковый рацион помогает при создании желаемой фигуры: именно на их основе формируется мускулатура, а на стадии их переваривания происходит интенсивный расход калорий, что также способствует похудению. Однако полезные свойства этим не ограничиваются. Что же еще они умеют?

Защищают

Для свертывания крови задействованы специальные белки, имеющие названия фибриноген и тромбин. Благодаря им осуществляется защита кожи (дермы) и предотвращается кровопотеря при повреждениях капилляров и сосудов. Одновременно, они предоставляют нам защиту на химическом уровне, непосредственно принимая участие в генерировании важнейших нам антител.

Регулируют

Существует ряд белков, не представляющих собой энергетический источник и их нельзя назвать «строительным материалом». Они призваны выполнять регулирующую функцию во внутриклеточных процессах. В этом и заключается их основная задача.

Сигнализируют

Белок передает сигналы между тканями, внутренними органами и на клеточном уровне и сообщает о подступающей опасности. Яркая иллюстрация этому – инсулин, который оповещает печень и кишечник о том, что сейчас не требуется перерабатывать белки, поступившие внутрь, в глюкозу.

Помогают нам двигаться

Актин и миозин — эти белки при соединении образуют актомиозин – ключевой элемент сократительных мышц. Нельзя не упомянуть про ключевой компонент хрящей и сухожилий – белок коллаген, который славится своей сверхвысокой прочностью.

Участвуют в производстве потомства.

Гены и хромосомы – вы не поверите, но и это — белок, принимающий активное участие в создании новых форм жизни. А ведь для этого требуется колоссальное количество белка в сочетании с непрерывным притоком свободных аминокислот. В случае, если эти поступления нерегулярны, функция продолжения рода становится невозможной.

Способствуют выработке энергии

В ситуации голодания роль белков резко увеличивается. Их запас обеспечивает нас столь необходимой человеку энергией.

Строят

Белки – это первостепенный клеточный строительный материал. Большинство плотных тканей – мышечная, волосы, опорные – состоят именно из них. При образовании мембран клеток также всегда используются белки.

Продукты, с высоким белковым содержанием

Куриную грудку недаром называют главным блюдом в холодильнике спортсмена. В одной порции содержится примерно 200 ккал, 40 г белка и всего лишь 2 г жира. К её неоспоримым достоинствам можно отнести быстрое время приготовления и универсальность: на основе куриной грудки можно приготовить множество интересных блюд и закусок.

Еще один продукт, насыщенный белком – это обычное яйцо. Употреблять его без желтка нет смысла: именно желток даёт возможность белку хорошо и быстро усваиваться. Всегда держите в холодильнике упаковку яиц на случай, если нет времени готовить, а безвредный и сытный перекус желателен.

Лосось – тот самый случай, когда вкусное сочетается с полезным. В филе лосося в среднем присутствует примерно 370 ккал, 40 грамм белка и 28 – жиров. Ну и, конечно, огромное количество необходимых кислот Омега-3.

Признаки нехватка белка

В первую очередь их поможет установить врач: анализ крови расскажет, какой из показателей выбивается из нормы и нуждается в коррекции. Так, о нехватке могут сигнализировать заниженные показатели гемоглобина: нарушается транспортная функция этого вещества, происходит кислородное голодание, может развиться анемия. Кроме того, вычислить недостаток можно и по косвенным критериям: состоянию ногтей, зубов и волосяного покрова. Если оно сильно испортилось в последнее время, есть смысл сдать анализы и произвести над этим работу.

Если хотите готовый рацион питания, наши специалисты по правильному питанию подготовят для вас готовую сбалансированную еду и доставят в любую точку Москвы.

Машинное обучение ускорит поиск мишеней для лекарств

Structura Biotechnology Inc.

Канадские ученые применили методы машинного обучения для восстановления 3D-формы молекул белка из двухмерных изображений, полученных криомикроскопией. Высокое разрешение, точность и быстродействие нового метода обещают существенно упростить разработку средств для лекарственной терапии широкого диапазона болезней, включая онкологические заболевания и болезнь Альцгеймера. Описание работы опубликовано в журнале Nature Methods.

Одно из направлений современной медицины — таргетированная терапия, основанная на выявлении особенностей молекулярной патологии: лекарственный препарат находит нетипичные молекулы белка, связывается с ними и изменяет их форму, меняя поведение белка в организме. Идеальный препарат может связываться только со специфическими белками, форма которых обусловлена конкретной болезнью — таким образом можно избежать побочных эффектов, которые возникают при связывании препарата с другими белками в организме. Таким образом, разработка новых лекарственных препаратов напоминает сборку пазла: не зная трехмерную форму белка, задача становится практически не разрешимой.

Одним из многообещающих подходов восстановления трехмерной структуры белков основан на использовании микроскопических двухмерных изображений, полученных методом электронной криомикроскопии (крио-ЭМ). Этот метод использует электронные микроскопы для выполнения десятков тысяч снимков замороженных образцов белка под разными углами. После того, как получены двухмерные изображения, их нужно объединить в точную 3D-модель высокого разрешения.

Существующие методы позволяют выполнить эту задачу за несколько дней, а то и недель, с использованием кластера мощных компьютеров; при этом для их работы требуется исходная экспертная оценка молекулы, структуру которой нужно восстановить.

Новый подход основан на применении стохастического градиентного спуска (SGD), а также алгоритмов оптимизации на базе методов максимального правдоподобия и метода ветвей и границ. Набор методов машинного обучения объединен в программу cryoSPARC (cryo-EM Single-Particle Ab initio Reconstruction and Classification), которая работает на базе графических процессоров (GPU). Программа выполняет задачу определения структуры молекулы в течение нескольких часов или даже минут, а основное новшество метода заключается в том, что метод не требует предварительных экспертных знаний о структуре молекулы белка, что позволяет получать в том числе вполне неожиданные структуры макромолекул.

Стандартные методы градиентного спуска, применяемые для приближения трехмерных моделей, чувствительны к первоначальной инициализации: произвольная начальная картинка может привести к локальному минимуму функции ошибки, далекому от искомой 3D-модели, в то время как корректная инициализация приведет к корректной модели (глобальному минимуму) — поэтому важно иметь предварительную экспертную оценку искомой структуры. При этом классический подход использует все исходные двухмерные изображения на каждом шаге, что значительно замедляет процесс. Примененный в новой работе модифицированный метод стохастического градиентного спуска на каждой итерации использует некоторое произвольным образом выбранное подмножество начальных двухмерных изображений для аппроксимации 3D-модели; при каждой итерации метод использует градиенты, рассчитанные на основе случайного набора исходных изображений, что позволяет избежать застревания в локальном минимуме и обеспечить многократное обновление восстанавливаемой модели за один проход всего исходного набора двухмерных изображений.

(a) Стандартный метод градиентного спуска. (b) Выбор подмножества исходных изображений для шага метода SGD. (c) Сходимость модифицированного метода SGD к глобальному оптимуму.

Ali Punjani et al. / Nature Methods

Метод был протестирован на известных наборах данных для молекул рибосомы и протеасомы: полученные модели обеспечили разрешение около трех ангстремов (один ангстрем равен 10−10 метра), при этом модели были построены за два часа и 70 минут соответственно — в известных аналогах построение этих моделей занимает около 20 часов.

Методы оптимизации позволяют добиться изображений высокого разрешения. На картинке схема протеасомы, полученная за 70 минут работы программы из 49954 исходных двухмерных изображений.

Ali Punjani et al. / Nature Methods

Ученые рассчитывают, что новый метод даст новаторский подход к изучению объектов структурной биологии и поможет в создании новых лекарств.

Надежда Бессонова

§ 9. Физико-химические свойства белков

§ 9. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Белки – это очень крупные молекулы, по своим размерам они могут уступать только отдельным представителям нуклеиновых кислот и полисахаридам. В таблице 4 представлены молекулярные характеристики некоторые белков.

 

Таблица 4

Молекулярные характеристики некоторых белков

Белок

Относитель-ная молекулярная масса

Число цепей

Число аминокислотных остатков

Инсулин

5733

2

51

Рибонуклеаза

13683

1

124

Миоглобин

16890

1

153

Химотрипсин

22600

3

241

Гемоглобин

64500

4

574

Глутамат-дегидрогеназа

~1000000

~40

~8300

В молекулах белков может содержаться самое разное количество аминокислотных остатков — от 50 и до нескольких тысяч; относительные молекулярные массы белков также сильно колеблются — от нескольких тысяч (инсулин, рибонуклеаза) до миллиона (глутаматдегидрогеназа) и более. Число полипептидных цепей в составе белков может составлять от единицы до нескольких десятков и даже тысяч. Так, в состав белка вируса табачной мозаики входит 2120 протомеров.

Зная относительную молекулярную массу белка, можно приблизительно оценить, какое число аминокислотных остатков входит в его состав. Средняя относительная молекулярная масса аминокислот, образующих полипептидную цепь, равна 128. При образовании пептидной связи происходит отщепление молекулы воды, следовательно, средняя относительная масса аминокислотного остатка составит 128 – 18 = 110. Используя эти данные, можно подсчитать, что белок с относительной молекулярной массой 100000 будет состоять приблизительно из 909 аминокислотных остатков.

 

Электрические свойства белковых молекул

Электрические свойства белков определяются присутствием на их поверхности положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Наличие заряженных группировок белка определяет суммарный заряд белковой молекулы. Если в белках преобладают отрицательно заряженные аминокислоты, то его молекула в нейтральном растворе будет иметь отрицательный заряд, если преобладают положительно заряженные – молекула будет иметь положительный заряд. Суммарный заряд белковой молекулы зависит и от кислотности (рН) среды. При увеличении концентрации ионов водорода (увеличении кислотности) происходит подавление диссоциации карбоксильных групп:

и в то же время увеличивается число протонированных амино-групп;  

Таким образом, при увеличении кислотности среды происходит уменьшение на поверхности молекулы белка числа отрицательно заряженных и увеличение числа положительно заряженных групп. Совсем другая картина наблюдается при снижении концентрации ионов водорода и увеличении концентрации гидроксид-ионов. Число диссоциированных карбоксильных групп возрастает 

 

и снижается число протонированных аминогрупп 

.

Итак, изменяя кислотность среды, можно изменить и заряд молекулы белка. При увеличении кислотности среды в молекуле белка снижается число отрицательно заряженных группировок и увеличивается число положительно заряженных, молекула постепенно теряет отрицательный и приобретает положительный заряд. При снижении кислотности раствора наблюдается противоположная картина. Очевидно, что при определенных значениях рН  молекула будет электронейтральной, т.е. число положительно заряженных групп будет равно числу отрицательно заряженных групп, и суммарный заряд молекулы будет равен нулю (рис. 14).

Значение рН, при котором суммарный заряд белка равен нулю, называется изоэлектрической точкой и обозначается pI.

Рис. 14. В состоянии изоэлектрической точки суммарный заряд молекулы белка равен нулю

Изоэлектрическая точка для большинства белков находится в области рН от 4,5 до 6,5. Однако есть и исключения. Ниже приведены изоэлектрические точки некоторых белков: 

Белок

pI

Пепсин

1,0

Каталаза

5,1

Рибонуклеаза

7,8

Лизоцим

11,0

При значениях рН ниже  изоэлектрической точки белок несет суммарный положительный заряд, выше – суммарный отрицательный.

В изоэлектрической точке растворимость белка минимальна, так как его молекулы в таком состоянии электронейтральны  и между ними нет сил взаимного отталкивания, поэтому  они могут «слипаться» за счет водородных и ионных связей, гидрофобных взаимодействий, ван-дер-ваальсовых сил.  При значениях рН, отличающихся от рI, молекулы белка будут нести одинаковый заряд — либо положительный, либо отрицательный. В результате этого между молекулами будут существовать силы электростатического отталкивания, препятствующие их «слипанию», растворимость будет выше.

 

Растворимость белков

Белки бывают растворимые и нерастворимые в воде. Растворимость белков зависит от их структуры, величины рН, солевого состава раствора, температуры и других факторов и определяется природой тех групп, которые находятся на поверхности белковой молекулы. К нерастворимым белкам относятся кератин (волосы, ногти, перья), коллаген (сухожилия), фиброин (щелк, паутина).  Многие другие белки растворимы в воде. Растворимость определяется наличием на их поверхности заряженных и полярных группировок (-СОО, -NH3+, -OH и др.). Заряженные и полярные группировки белков притягивают к себе молекулы воды, и вокруг них формируется гидратная оболочка (рис. 15), существование которой обусловливает их растворимость в воде.

Рис. 15. Образование гидратной оболочки вокруг молекулы белка.

На растворимость белка влияет наличие нейтральных солей (Na2SO4, (NH4)2SO4 и др.) в растворе. При малых концентрациях солей растворимость белка увеличивается (рис. 16), так как в таких условиях увеличивается степень диссоциации полярных групп и экранируются заряженные группы белковых молекул, тем самым снижается белок-белковое взаимодействие, способствующее образованию агрегатов и выпадению белка в осадок. При высоких концентрациях солей растворимость белка снижается (рис. 16) вследствие разрушения гидратной оболочки, приводящего к агрегации молекул белка.

Рис. 16. Зависимость растворимости белка от концентрации соли

Существуют белки, которые растворяются только в растворах солей и не растворяются в чистой воде, такие белки называют глобулины. Существуют и другие белки – альбумины, они в отличие от глобулинов хорошо растворимы в чистой воде.
Растворимость белков зависит и от рН растворов. Как мы уже отмечали, минимальной растворимостью обладают белки в изоэлектрической точке, что объясняется отсутствием электростатического отталкивания между молекулами белка.
При определенных условиях белки могут образовывать гели. При образовании геля молекулы белка формируют густую сеть, внутреннее пространство которой заполнено растворителем. Гели образуют, например, желатина (этот белок используют для приготовления желе) и белки молока при приготовлении простокваши.
На растворимость белка оказывает влияние и температура. При действии высокой температуры многие белки выпадают в осадок вследствие нарушения их структуры, но об этом более подробно поговорим в следующем разделе.

 

Денатурация белка

Рассмотрим хорошо нам знакомое явление. При нагревании яичного белка происходит постепенное его помутнение, и затем образуется твердый сгусток. Свернувшийся яичный белок – яичный альбумин – после охлаждения оказывается нерастворимым, в то время как до нагревания яичный белок хорошо растворялся в воде. Такие же явления происходят и при нагревании практически всех глобулярных белков. Те изменения, которые произошли при нагревании, называются денатурацией. Белки в естественном состоянии носят название нативных белков, а после денатурации — денатурированных.
При денатурации происходит нарушение нативной кон-формации белков в результате разрыва слабых связей (ион-ных, водородных, гидрофобных взаимодействий). В результате этого процесса могут разрушаться четвертичная, третичная и вторичные структуры белка. Первичная структура при этом сохраняется (рис. 17).

Рис. 17. Денатурация белка

При  денатурации гидрофобные радикалы аминокислот, находящиеся в нативных белках в глубине молекулы, оказываются на поверхности, в результате создаются условия для агрегации. Агрегаты белковых молекул выпадают в осадок. Денатурация сопровождается потерей биологической функции белка.

Денатурация белка может быть вызвана не только повышенной температурой, но и другими факторами. Кислоты и щелочи способны вызвать денатурацию белка: в результате их действия происходит перезарядка ионогенных групп, что приводит к разрыву ионных и водородных связей. Мочевина разрушает водородные связи, следствием этого является потеря белками своей нативной структуры. Денатурирующими агентами являются органические растворители и ионы тяжелых металлов: органические растворители разрушают гидрофобные связи, а ионы тяжелых металлов образуют нерастворимые комплексы с белками.

Наряду с денатурацией существует и обратный процесс – ренатурация. При снятии денатурирующего фактора возможно восстановление исходной нативной структуры. Например, при медленном охлаждении до комнатной температуры раствора восстанавливается нативная структура и биологическая функция трипсина.

Белки могут денатурировать и в клетке при протекании нормальных процессов жизнедеятельности. Совершенно очевидно, что утрата нативной структуры и функции белков – крайне нежелательное событие. В связи с этим следует упомянуть об особых белках – шаперонах. Эти белки способны узнавать частично денатурированные белки и, связываясь с ними, восстанавливать их нативную конформацию. Шапероны также узнают белки, процесс денатурации которых зашел далеко, и транспортируют их в лизосомы, где происходит их расщепление (деградация). Шапероны играют важную роль и в процессе формирования третичной и четвертичной структур во время синтеза белка.

Интересно знать! В настоящее время часто упоминается такое заболевание, как коровье бешенство. Эту болезнь вызывают прионы. Они могут вызывать у животных и человека и другие заболевания, носящие нейродегенеративный характер. Прионы – это инфекционные агенты белковой природы. Прион, попадая в клетку, вызывает изменение конформации своего клеточного аналога, который сам становится прионом. Так возникает заболевание. Прионный белок отличается от клеточного по вторичной структуре. Прионная форма белка имеет в основном b-складчатую структуру, а клеточная – a-спиральную.

Форма молекул белковых — Справочник химика 21

    В дезоксигемоглобине Ре(П) находится в высокоспиновом состоянии и расположен вне плоскости порфиринового кольца. Однако при связывании О2 Ре(П) переходит в низкоспиновое состояние и возвращается в плоскость. Это, очевидно, приводит к смещению проксимального имидазольного кольца на 0,06 нм, что вызывает конформационные изменения в структуре белка в результате сродство тетрамерной формы молекулы белка к кислороду О2 становится выще. Это структурное изменение ле- [c.360]
    Размеры и форма молекул белка [c.102]

    Существуют различные методы определения формы молекул. Величиной, характеризующей форму молекулы белка, янляется соотношение осей ///q (как уже было сказано, почти все белки имеют форму, отличную от сферы)  [c.362]

    Форма молекулы белка с ярко выраженной третичной структурой может быть определена как форма клубка , т.е. структуры неопределенной, но жестко фиксированной геометрической формы в отличие от клубка ниток, структура которого носит случайный характер и не воспроизводится при повторной процедуре его образования. Что это значит Это значит, что белковый клубок, каждая петля которого [c.98]

    Как вы видели (рис. VII.10 и VII.20), волосы состоят из переплетенных белковых цепей. Отдельные цепи удерживаются водородными, ионными и ди-сульфидными свя зями, как это было показано при обсуждении форм молекул белка (рис. П.9, разд. А. 10). [c.477]

    Полинг (первым предположивший, что молекулы белков и нуклеиновых кислот имеют форму спирали, см. гл. 10) в начале 30-х годов разработал методы, позволившие при рассмотрении органических реакций учитывать волновую природу электронов. [c.161]

    Водородные связи способствуют образованию разнообразных структур и играют большую роль среди факторов, определяющих геометрические конфигурации и свойства многих химических систем. Эти связи существуют в кристаллах льда и в жидкой воде, стабилизируют спиральную форму молекул белков (наряду с ди-сульфидными связями), обусловливают полимеризацию молекул органических кислот, цепное строение бикарбонатных ионов О О [c.133]

    По форме молекул белки делят на две большие группы — фибриллярные и глобулярные. Полипептидные цепи фибриллярных белков соединяются друг с другом посредством водородной связи, что приводит к образованию сложных спиралевидных структур, называемых вторичной структурой белка. [c.432]

    По-видимому, жесткие спиральные участки в цепи глобулярного белка необходимы для поддержания нужной формы молекулы. Денатурация приводит к раскручиванию спиралей и разрушению характеристичной формы молекулы белка, в результате чего она утрачивает свою специфическою биологическую активность. [c.1061]

    Изменяя форму, молекулы белка или их ассоциаты создают вокруг реакционных центров, входящих в молекулу белка или же входящих в состав /ФугОй молекулы, связанной с белком, соответствующее пространственное окр> ение. Это окружение, в свою очередь, создает благоприятные стерические условия для протекания одних реакций и неприемлемые условия для других. Такое явление называют стерическими помехами или полным атомно-молекулярным экранированием реакционного центра. На этом принципе стерического благоприятствования, или стерического экранирования, за счет молекул белка осуществляют свои Избирательные функции биологические катализаторы, называемые ферментами или энзимами. [c.43]


    Определение формы молекулы. Белки по своей форме разделяют на глобулярные и фибриллярные. Форма молекул глобулярных белков динамична и под влиянием ряда факторов, например pH, температуры или ионной силы раствора, может изменяться. Это обязательно нужно учитывать при определении формы белка. Одним из наиболее точных методов, регистрирующих форму белковой молекулы, является метод двойного лучепреломления в потоке. Отклонение формы молекул от сферической выражается отношением фрикционных коэффициентов f f , которое для глобулярных белков, имеющих шарообразную форму, близко к 1 (/— молярный коэффициент трения). Зная величину можно рассчитать соотношение осей молекулы белка. [c.45]

    По форме молекулы белки делятся на два класса глобулярные и фибриллярные белки. [c.47]

    Если известен молекулярный вес, то знание коэффициента диффузии позволяет составить ориентировочное представление о форме молекулы белка в растворе. Отклонение величины ///о, называемой фрикционным отношением, от единицы может служить мерой асимметрии и гидратации молекулы белка (индексы а ж к относятся соответственно к асимметрии [c.67]

    Несмотря на то что использованные методы были весьма различными, полученные результаты, в общем, довольно хорошо согласуются между собой (для одного и того же белка). Установлено, что молекулярные веса различных протеинов колеблются от 6000—12 ООО до нескольких миллионов и даже до десятков миллионов, чаще всего от 20 000 до 90 000. Форма макромолекул найдена весьма различной от частиц почти шарообразных, лишь несколько удлиненных, до вытянутых, нитевидных. В первом случае говорят о глобулярных белках, во втором — о фибриллярных. Большинство ферментов и других специфически активных протеинов представляет собой глобулярные белки. Обычно, характеризуя форму белковых частиц и степень их асимметрии, условно пользуются представлением о гидродинамически эквивалентном эллипсоиде, приближенно принимаемом за форму молекулы белка. При этом указывают величину отношения размеров его полуосей — s/a. Здесь в — продольная и а — поперечная полуоси. Величина е/а колеблется у различных белков примерно от 1 до 200. У глобулярных белков (в том числе ферментов) она обычно составляет от 1—2 до 4—6. Следует отметить, что истинные формы белковых молекул далеко не ясны и поэтому величины подобного рода имеют в определенной мере условный характер. [c.31]

    Тенденция полипептидной цепи принимать развернутую или свернутую форму зависит от природы остатков аминокислот. В зависимости от формы молекул белки можно разделить на 2 группы фибриллярные и глобулярные. Первые имеют форму вытянутых молекул, вторые — эллиптических. Существует два типа фибриллярных белков, а именно белки, подобные кератину и миозину, и белки, подобные коллагену. В фибриллярных белках типа кератина нормальной структурой полипептидной цепи является одинарная спираль с внутренними [c.82]

    Белки, форма молекул. Белковые молекулы могут быть шарообразными, глобулярными, а также удлиненными, нитевидными, фибриллярными. Чаще всего форма молекулы белка асимметричная, вытянутая. На рис. 4 показаны в соотношении р-мы и размеры некоторых молекул белка. [c.17]

    В ближайшем будуш,ем будут возможны полный рентгеноструктурный анализ двух кристаллических модификаций какого-либо глобулярного белка, а следовательно, и оценка размеров возможных изменений формы молекул. Во всяком случае, если форма молекулы белка в разбавленном растворе отличается от ее формы в кристаллической решетке, следует полагать, что свойства молекулы в растворе имеют более важное значение с точки зрения ее функций в живом организме. Следовательно, кристаллографические методы и методы исследования макромолекул в растворе [c.32]

Рис. 3-30. Возможные размеры и форма молекулы белка из 300 аминокислот. Конкретная структура определяется последовательностью
    По форме молекул белки можно разделить на две большие группы — глобулярные (имеющие сферическую форму) и фибриллярные (удлиненной формы). [c.26]     Слишком сильные изменения окружающей среды, однако, могут привести к потере белком его свойств из-за чрезмерного изменения формы молекулы. Тепло, спирт или другие растворители, соли тяжелых металлов или изменение кислотности могут изменить форму белка из-за разрушения связей между цепями (рис. VII.11). В некоторых случаях изменения, называемые дена- [c.455]
    Чужие белки часто включаются в тело как часть болезнетворных агентов -вирусов, бактерий, грибков, паразитов. Химия тела так сильно зависит от наличия нужных белков в определенном месте, в определенное время и в нужном количестве, что при появлении чужого белка сразу вырабатывается сигнал для нейтрализации возможной опасности. Стратегия защиты организма иммунной системой заключается в синтезе белков, окружающих часть молекулы чужого белка. Опять биохимическое взаимодействие становится возможным из-за соответствия формы молекул антител и антигенов (свойство комплементарности). Если молекула захватчика будет окружена, она не сможет причинить вреда. [c.486]

    Дальнейшее скручивание вторичной структуры определяет внешнюю форму молекулы белка, которая называется третичной структурой. Она стабилизируется за счет взаимодействия тех функциональных групп, которые не участвуют в образовашта полипептидной цепи первичной структуры белка. [c.432]

    По форме молекул белки можно приблизительно делить на две группы — склеропротеины и сферопротеины. Первые имеют волокнистую структуру и служат строительным материалом тканей. К ним относится коллаген, содержащийся в коже, сухожилиях, хрящах и костях. Коллаген построен в основном из глицина, пролина и оксипролина. При частичном гидролизе он превращается в желатину. Коллаген составляет почти одну треть всех животных белков. Другие склеропротеины — кератин, содержащийся в волосах, ногтях, перьях и шерсти, и фиброин из натурального шелка. В мышечных волокнах присутствуют главным образом белки миозин и актин. Они не растворяются в воде и активно участвуют в механохимических процессах, обусловливающих работу мышц. Поскольку тела млекопитающих примерно на 40% состоят из мышц, оба этих белка относятся к наиболее распространенным органическим соединениям в организмах млекопитающих. [c.194]

    Однако это не так. Дело в том, что под словом меньше мы не вправе подразумевать молекулярную массу белка, а должньс оценивать тот параметр, который действительно определяет возможность проникновения белка в поры геля,— его молекулярные размеры. Но если плотности всех нативных белков (за немногими исключениями) почти одинаковы, то их размеры, а точнее объемы, должны быть пропорциональны массам. Это верно, но остается еще один фактор, играющий в этом рассмотрении ключевую роль,— форма молекулы. Белковая глобула может быть почти шаром, а может напоминать палочку, поэтому ее поведение при гель-фильтрации (способность проникать в поры геля) будет совершенно различным в этнх двух случаях. Но можно ли составить представление о форме молекулы белка, если пе рассматривать ее (в нативном состоянии ) [c.146]

    Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

    Таким образом, можно утверждать, что специфика живой материи обусловлена белками, которые свои особые качества обретают в процессе самопроизвольного перехода полипептидной цепи от состояния флуктуирующего статистического клубка к нативной трехмерной структуре, в каждом случае уникальной по биологической функции Именно спонтанное образование фиксированной активной пространственной формы молекулы белка, а не сама форма, есть изначальная причина фундаментальных особенностей живой материи С чисто физической точки зрения этот уникальный акт творения живого заключается в спонтанной трансформации тепловой энергии необратимых флуктуаций в целенап равленную механическую работу создания высокоорганизованной системы Белки представляются почти единственными в природе (по меньшей мере самыми совершенными и распространенными) автоматическими молекулярными преобразователями энергии хаотического теплового дви- [c.56]

    Фибриллярные белки, в том числе волос, кожи, мышц и ногтей, выполняют струкпурные функции. Глобулярные белки, такие, как ферменты и гормоны, делают специфическую биохимическую работу. Сравните форму молекул и растворимость в воде этих двух классов белков. Почему растворимость в воде для фибриллярных белков часто так сильно отличается от растпоримости в воде глобулярных белков  [c.457]

    Мы далее узнаем, как велика роль водородных связей в поддержании формы молекул белков и образовании сложных двойных спиралей полинуклеиновых кислот. [c.30]

    Равновесие 2К5Н- — /гОг = — ЗН + НгО сильно сдвинуто вправо, если раствор нейтрален или содержит неболь-щие количества щелочей в кислых растворах, наоборот, устойчивы сульфгидрильные группы 5Н. Связи — 5 —5 — могут быть внутримолекулярными или связывать мономерные единицы белка (например, сывороточный альбумин) в одну крупную частицу. В стабилизации формы молекулы играют роль и гидрофобные связи. Гидрофобные связи возникают за счет сил взаимодействия между углеводородными частями молекул белка. Углеводородные группы белковых частиц, находящихся в водной среде, ориентированы во внутренние зоны частицы, а гидрофильные группы (ОН, СООН) находятся на внещней стороне, которая обращена к воде. Вследствие этого внутри молекулы белка возникает углеводородное ядро, причем для того, чтобы его разрушить и перевести углеводородные группы в водную среду, надо затратить работу. Это и означает, что между углеводородными частями молекулы действуют силы притяжения. Кроме водородных, дисуль-фидных и гидрофобных связей, в поддержании формы молекулы белка принимают участие и другие факторы имеет значение возникновение солевых мостиков, действие сил Ван-дер-Ваальса особенно большое влияние оказывают молекулы воды. Сохранение определенной формы молекулы важно с биологической точки зрения. Оно обеспечивает, в частности, такое взаимное расположение групп атомов на поверхности молекулы, которое необходимо для проявления каталитической активности белка, его гормональных функций и т. д. Поэтому устойчивость глобул, так же как и многие особенности структур биологически активных молекул, не случайное свойство, а одно из средств стабилизации организма. [c.57]

    Определение размера и формы молекулы белка или полипептида прямым наблюдением имеет несомненные преимущества. Так как биополимеры слишком малы, чтобы их можно было наблюдать в обычном микроскопе с видимым светом, то приходится использовать электронный микроскоп, в котором обычный свет заменен пучком электронов, фокусируемым электромагнитными линзами. Очень малая длина волны электронных пучков теоретически должна обеспечить крайне высокую разрешающую способность — порядка 0,005 А. Однако различные трудности значительно понижают лувствительность метода, и эффективная разрешающая способность для лучших современных электронных микроскопов составляет около 5— 10 А. Этого вполне достаточно, чтобы позволить оценить размеры и формы белковой молекулы или увидеть а-спираль синтетического полипептида. [c.110]

    Белки, классификация. По форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные, по физико-химическим свойствам — на простые (протеины) и сложные (протеиды). Простыми называются такие, которые при расщеплении дают только аминокислоты. В J)eзyльтaтe гидролиза сложных белков в гидролизате наряду с аминокислотами содержатся вещества небелковой природы (липиды, углеводы, нуклеотиды и др.). [c.14]

    До появления работ Полинга было множество попыток описать структуру протеинов в виде молекулярных спиралей, стабилизированных внутримолекулярными водородными связями. Первые работы Астбюри [3] показали, что молекулы белков, особенно шерсти, могут существовать в вытянутых или свернутых конформациях, причем предполагалось, что последние имеют форму спиралей. Эти идеи были использованы Эллиотом, Бэмфордом и сотр. 14—6] при исследовании структуры полиаминокислот в пленках и волокнах. Свернутым формам молекул белков, о которых сообщал Астбюри, была приписана структура а-спирали. Было принято, что вытянутые формы, известные в первых публикациях под названием Р-форм, существуют в результате наличия внутримолекулярных водородных связей. В пленках, [c.605]

    ДНК-геликазы были впервые выделены как белки, которые, присоединяясь к одиночной цепи ДНК, катализируют гидролиз АТР. Как уже отмечалось в гл. 3, гидролиз АТР может циклическим образом изменять форму молекулы белка, вследствие чего белок будет производить механическую работу (см. разд. 3.4.11). Именно этот принцип лежит в основе быстрого неремещения ДНК-геликаз по одиночной цени ДНК. Встречая на своем пути участок двойной спирали, эти ферменты продолжают двигаться вдоль своей цепи и тем самым расплетают двойную спираль (рис. 5-44). Расплетание ДНК-снирали в области репликационной вилки, вероятно, осуществляется двумя совместно действующими ДНК-геликазами, одна из которых перемещается по ведущей цепи, а другая — по отстающей. Ясно, что две эти геликазы должны двигаться вдоль одиночных ценей ДНК в противоположных направлениях, т. е. это должны быть разные ферменты. Действительно, оба указанных типа ДНК-геликаз удалось обнаружить. Нри этом исследования на бактериях показали, что главную роль играет ДНК-геликаза отстающей цепи. Причины этого мы обсудим ниже. [c.292]

    Точная форма молекулы белка, такого, как гемоглобин, стабильна в том смысле, что две цепи, образованные одними и теми же последовательностями аминокислот, всегда, подобно двум пружинам, будут принимать совершенно одинаковую трехмерную конфигурацию. Одни гемоглобиновые кусты образуются в нашем организме в этой предпочитаемой ими форме со скоростью 4×10 » в секунду, а другие такие кусты столь же быстро разрушаются. [c.18]

    ТТретичная структура. Спиральные полипептидные цепи жестко фиксируются за счет взаимодействия боковых групп, аминокислот, приобретая специфическую для каждого белка пространственную структуру (конформацию). Это третичная структура белка. В зависимости от расположения полипептидных цепей форма молекул белка может варьировать от фибриллярной (вытянутой, нитеобразной) до глобулярной (округлой). [c.39]

    На поверхности молекулы фермента находится множество полярных групп. Так, например, на поверхности химотрипсина локализованы 4 остатка аргинина и 14 остатков лизина, которые имеют положительные заряды, и 7 остатков аспартата и 5 — глутамата, заряженных отрицательно. Это приводит к созданию вокруг молекулы фермента ионного окружения, т. е. электростатического поля, которое может стабилизировать или дестабилизировать находящиеся внутри белковой глобулы (или частично погруженные в нее) ионные группы. Проведенные Лин-дерстрём-Лангом расчеты показали, что изменение р/Са погруженных групп является сложной функцией размера и формы молекулы белка, а также ионной силы раствора [9]. Значение этих эффектов четко показано в ряде работ, в которых расположенные на поверхности карбоксилат- или аммоний-ионы подвергались химической модификации. [c.176]

    После доставки непосредственно к месту действия в организме, как дальше работает леклрство Специфичность лекарств, подобная специфичности ферментов, часто зависит от формы молекулы. Многие лекарства действуют на рецепторы — области белка или клеточной мембраны, по форме и химическим свойствам соответствующие лекарствам, — помогая начать требуемый биологический ответ (подавление боли, понижение температуры и т. д.) [c.481]

    Рассчитайте радиус молекулы белка, если его коэффициент диффу ии в растворе сахара Д = 6,39 10″ мV , Т = 298 К. Считайте, что молекулы белка имеют сферическую форму. [c.407]

    Некоторые из таких белков могут растягиваться, причем нерастянутая а-форма молекулы переходит в растянутую р-форму. Этот процесс может быть прослежен методами рентгеновского анализа и, по-видимому, отвечает переходу спиральной формы полипептидной цепи (а-спираль, стр. 382) в растянутую (складчатая цепь, стр. 383). Миозин мыщечной ткани, по растворимости относящийся к альбуминам, в известном отношении близок к таким нитевидным молекулам. Соединяясь с другим мышечным белком, актином, который может существовать и в нитевидной и в глобулярной формах, миозин образует актомиозин, обладающий высокой е1Язкостью в растворах. [c.397]


Школа одаренных детей. Занятие в 11-м классе «Химический состав клетки. Белки – строение, функции, значение»

Белки — это сложные органические соединения (биополимеры), состоящие из углерода, водорода, кислорода и азота, мономерами, которых являются аминокислоты. Молекулы белков имеют вид длинных цепей, которые состоят из 50-1500 аминокислот соединенных прочной пептидной связью.

(- СО- NН-)

Биополимеры (биологические полимеры) - органические соединения, макромолекулы которых состоят из мономеров. К биополимерам относятся белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и их производные ( целлюлоза, крахмал, гликоген, хитин). Биополимеры составляют 90 % сухой массы клетки. У животных преобладают белки, а у растений — полисахариды. Аминокислоты — это низкомолекулярные органические соединения, в состав которых входят одна или две аминогруппы и две карбоксильных группами (СООН), обладающими щелочными и кислотными свойствами.

В молекулу белка входят: C,H,O,N,S,P, иногда Fe. Железо всегда присутствует в гемоглобине крови, фосфор - в казеине молоке.

Выделяют 4 структуры белка

ПЕРВИЧНАЯ структура белка. В состав простых белков входят только аминокислоты. Различные свойства и функции белковых молекул определяются последовательностью соединения аминокислот, которая закодирована в ДНК. Первичная структура белковой молекулы обусловлена пептидными связями

ВТОРИЧНАЯ структура белков. Достигается ее спирализацией благодаря соединению водородными связями. Они слабее ковалентных, но многократно повторенные. Функционирование в виде закрученной спирали характерно для белков (Коллаген, фибриноген, миозин, актин).

ТРЕТИЧНАЯ структура (глобулярная) — она формируется путем многократного сворачивания спирали в трехмерное образование – глобулу. Это структура сшивается дисульфидными связями (-S-S-). Имеет большинство белков (Альбумины, глобулины).

ЧЕТВЕРТТИЧНАЯ структура — Для выполнения некоторых функций требуется участие белков с более высоким уровнем организации, при котором возникают объединение нескольких глобулярных белковых молекул в единую систему. Химические связи могут быть разные. Например, молекула гемоглобина состоит из четырех различных глобул и геминовой группы, содержащей ион железа.

Химические связи:

1. Ионные связи возникают в том случае, когда один или несколько электронов передаются от одного атома к другому (реакция между натрием и хлором) Атом натрия на внешней оболочки имеет положительный заряд + 1. Атом хлора имел семь электронов на внешней оболочки пробрел еще один и получает отрицательный заряд -1. У обоих атомов все электронные оболочки заполнены, следовательно, они стабильны. Такие заряженные частицы называются ионами.

2. Водородные связи образуются при участии атомов водорода соединенных с электроотрицательным атомом (обычно кислородом или азотом). Таким образом, связываются молекулы воды.

Утрата белковой молекулы своей структурной организации называется – денатурацией. Причины это 1) химические (кислоты, щелочи, спирт, соли тяжелых металлов), 2) физические (высокая температура и давление, ионизирующие излучения) факторы. Вначале разрушается 4 – слабая структура, затем 3, 2 и при жестких условиях первичная структура.

Ренатурация- восстановление структуры белка (если не была затронута первичная структура)- Это свойство широко использует в медицине для приготовления вакцин и сывороток, в пищевой промышленности для получения пищевых концентратов

Белки в организм входят в состав цитоплазмы, оболочки и ядра клеток, ферментов, плазмы крови, многих гормонов и гемоглобина. Источником для человека служат продукты животного происхождения: мясо, рыба, молоко, творог, яйца и частично растительного происхождения – бобовые. Белки расщепляются в желудке до аминокислот и всасываются в кровь. 10 аминокислот важные - незаменимые. Отсутствие некоторых из них приводит к нарушению синтеза белка.

По содержанию необходимых для организма аминокислот белки делятся:

Полноценные Неполноценные
(Белки молока, мяса, рыбы) (которые не содержат хотя бы одной из незаменимых аминокислот).

Белки обладают большой молекулярной массой: молекулярная масса альбумина (одного из белков яйца) – 36.000, гемоглобина -152.000, миозин (белок мышц) – 5000.000. Для сравнения: молекулярная масса спирта – 46, уксусной кислоты – 60, бензола – 78.

Белки бывают:

Простые

Из аминокислот

Фибрин, трипсин

Сложные

аминокисл.
и не белковую
простетическую группу
металлопротеины –  гемоглобин
ионы металла, углеводами(гликопротеины),
липидами (липопротеиды).

В зависимости от количества аминогрупп и карбоксильных групп, входящих в состав аминокислот, различают: нейтральные аминокислоты – имеющие одну карбоксильную группу и одну аминогруппу; основные аминокислоты - одна аминогруппа, более одной карбоксильной группы.

Аминокислоты являются амфотерными соединениями, так как в растворе они могут выступать в роли кислот, так и оснований. Это зависит от pH раствора. Чем больше кислых аминокислот в белке, тем ярче выражены его кислотные свойства. Способностью отдавать и присоединять H определяют буферные свойства белков. Один из самых мощных буферов – гемоглобин в эритроцитах, поддерживающий pH на постоянном уровне. Есть белки растворимые и нерастворимые (выполняющие механические функции) коллаген, фиброин. Белки активные – ферменты, и не активные, устойчивые к воздействию различных условий внешней среды

Пептиды — органические вещества, состоящие из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Образование пептидов происходит в результате реакции конденсации аминокислот.

Суточная потребность в белках 100-160 грамм. При избытке белки преобразуются в глюкозу и жир. Часть белков, входящих в состав клеток и часть аминокислот не используемых в синтезе белка, расщепляются с освобождение энергии (17,6 к ДЖ на 1 г вещества), и образованием продуктов распада, таких, как, вода, диоксид углерода, аммиак, мочевина. Продукты распада выводятся из организма в составе мочи, пота и частично с выдыхаемым воздухом.

Свойства белков.

1. Белки — преимущественно водорастворимые молекулы и, следовательно, могут проявлять свою функциональную активность только в водных растворах.

2. белковые молекулы несут большой поверхностный заряд – электрохимические эффекты. Например, изменение проницаемости мембран каталитической активности.

3. Белки — термолабильны, т. е. проявляют свою активность в узких температурных рамках.

Белки — азотосодержащие — потому что в состав всех белков входят аминокислоты. А аминокислоты характеризуются наличием функциональной аминогруппы, в состав которой входит азот.

Практическая работа по теме “Белки” 11 класс.

Работа в парах

1. Прилейте по 2 мл HO (перекиси водорода) в пробирки с кусочком сырого мяса, с сырым и вареным картофелем. Объясните наблюдаемые вами явлениями при действии пероксида на живые и мертвые клетки

Прилейте по 2 мл HO (перекиси водорода) в пробирки с кусочком сырого мяса, с сырым и вареным картофелем. Объясните наблюдаемые вами явлениями при действии пероксида на живые и мертвые клетки (в пробирке сваренным картофелем). Результаты обоснуйте.

Практическая работа по теме “Белки” 11 класс

Работа в парах

1. Прилейте по 2 мл HO (перекиси водорода) в пробирки с кусочком сырого мяса, с сырым и вареным картофелем. Объясните наблюдаемые вами явлениями при действии пероксида на живые и мертвые клетки

Прилейте по 2 мл HO (перекиси водорода) в пробирки с кусочком сырого мяса, с сырым и вареным картофелем. Объясните наблюдаемые вами явлениями при действии пероксида на живые и мертвые клетки (в пробирке сваренным картофелем). Результаты обоснуйте.

Практическая работа по теме “Белки” 11 класс

Работа в парах

1. Прилейте по 2 мл HO (перекиси водорода) в пробирки с кусочком сырого мяса, с сырым и вареным картофелем. Объясните наблюдаемые вами явлениями при действии пероксида на живые и мертвые клетки

Прилейте по 2 мл HO (перекиси водорода) в пробирки с кусочком сырого мяса, с сырым и вареным картофелем. Объясните наблюдаемые вами явлениями при действии пероксида на живые и мертвые клетки (в пробирке сваренным картофелем). Результаты обоснуйте.

Тестовый контроль 11 класс “Строение белков”

1. Какие органические вещества в клетке на первом месте по массе?

1. Углеводы 3. Липиды
2. Белки. 4. Нуклеиновые кислоты.

2. Какие элементы входят в состав простых белков?

1. Углерод. 3. Кислород. 5. Фосфор. 7. Железо.
2. Водород. 4. Сера. 6. Азот. 8. Хлор.

3. Сколько аминокислот образует все многообразие белков?

1. 170.

2. 26.

3. 20.

4. 10.

4. Сколько аминокислот являются незаменимыми для человека?

1. Таких аминокислот нет, 2. 20, 3. 10, 4. 7.

5. Какие белки называются неполноценными?

1. В которых отсутствуют некоторые аминокислоты.

2. В которых отсутствуют некоторые незаменимые аминокислоты.

3. В которых отсутствуют некоторые заменимые аминокислоты.

4. Все известные белки являются полноценными.

6. Какая функциональная группировка придает аминокислоте — кислые, какая — щелочные свойства?

1. Кислые — радикал, щелочные – аминогруппа.

2. Кислые — аминогруппа, щелочные – радикал.

3. Кислые — карбоксильная группа, щелочные - радикал.

4. Кислые — карбоксильная группа, щелочные - аминогруппа.

7. В результате, какой реакции образуется пептидная связь?

1. Реакция гидролиза

2. Реакция гидратации.

3. Реакция конденсации.

4. Все вышеперечисленные реакции могут привести к образованию пептидной связи.

8. Между какими группировками аминокислот образуется пептидная связь?

1. Между карбоксильными группами соседних аминокислот.

2. Между аминогруппами соседних аминокислот.

3. Между аминогруппой одной аминокислоты и радикалом другой.

4. Между аминогруппой одной аминокислоты и карбоксильной группой другой.

9. Какие связи стабилизируют вторичную структуру белков?

1. Ковалентные. 3. Ионные.
2. Водородные. 4. Такие связи отсутствуют.

10. Какую структуру имеет молекула гемоглобина?

1. Первичную. 3. Третичную.
2. Вторичную. 4. Четвертичную.

11. Почему белки называют — азотосодержащими?

Многофункциональные белки (молекулярная биология)

Многофункциональные белки объединяют несколько автономных функций в одной полипептидной цепи. В этом смысле автономия подразумевает, что каждая функция закреплена за отдельной областью или доменом полипептидной цепи. Многофункциональные белки отличаются от мультиферментных комплексов, в которых различные полипептиды связаны нековалентно. Это определение не включает ферменты, катализирующие разные реакции с использованием одного и того же активного центра, такие как аспарагиназа, функционирующая как глутаминаза, фосфоглицеромутаза, которая может катализировать три разные реакции с использованием одного и того же реакционного центра, или цистатионин-g-синтаза, которая может катализировать целый ряд аналогичных реакций. реакций из-за относительной недостаточности субстратной специфичности.Аллостерические ферменты не считаются многофункциональными. Хотя они и обладают сайтами связывания эффекторных лигандов (ингибиторов или активаторов), расположенными в разных участках полипептидной цепи, они определены только в отношении каталитической функции.

Многофункциональные белки, как правило, имеют разные каталитические функции, находящиеся в отдельных доменах одной и той же полипептидной цепи. Несколькими примерами у Escherichia coli являются ДНК-полимераза I, фосфорибозилантранилатизомераза-индолглицеролфосфатсинтетаза ((1), (2)) (см. TRP Operon), аспартаткиназы-гомосериндегидрогеназы ((3), (4)) и хоризматмутаза- префенатдегидрогеназа ((5),(6)).У Neurospora crassa две функции триптофансинтазы (см. TRP Operon), а именно расщепление индолглицеролфосфата и соединение индола с серином, выполняются на одной и той же полипептидной цепи, тогда как у E. coli каждая из них выполняется независимой цепью. нековалентно связаны друг с другом. В этом случае фермент E. coli представляет собой не многофункциональный белок, а мультиферментный комплекс ((7),(8)).

Другими примерами являются флавоцитохром b2 Saccharomyces cerevisiae (9), гомотетрамер, который представляет собой как l-лактат-цитохром с-оксидоредуктазу (флавопротеин), так и цитохром b 2.

1. Более двух каталитических функций могут быть слиты в одной и той же полипептидной цепи

ДНК-полимераза I из E. coli представляет собой мономер, обладающий тремя видами активности: ДНК-полимераза, 5′-3′-экзонуклеаза и 3′-5′-экзонуклеаза (10). Карбамилфосфатсинтетаза из клеток асцитной гепатомы представляет собой гомотетрамер, также наделенный активностью аспартатранскарбамоилазы (у E. coli эта активность осуществляется независимыми белками) ((11),(12)). У N. crassa одна полипептидная цепь, организованная в виде гомодимера, отвечает за пять биохимических реакций, ведущих к биосинтезу ароматического кольца (13).б6) состоит из двух многофункциональных белков. Один из полипептидов несет активность малонилтрансацетилазы, β-гидроксиацилдегидразы, еноилредуктазы и пальмитилдеацилазы, тогда как другая полипептидная цепь несет β-кетоацилсинтазу, β-кетоацилредуктазу и белок-носитель ацила. В сочетании с ацетил-КоА-карбоксилазой комплекс катализирует конденсацию ацетильных субъединиц в конечный продукт — пальмитиновую кислоту (14). Синтетаза жирных кислот птиц, которая осуществляет ту же серию реакций, представляет собой гомодимер, организованный по принципу «голова к хвосту».Каждый из идентичных полипептидов несет все вышеперечисленные ферменты (15).

2. Каталитические и некаталитические функции могут быть слиты

В случае цитохрома b2 из микросом печени теленка один домен белка представляет собственно цитохром b2, тогда как другой домен отвечает за якорную функцию (16). Гомодимерный меромиозин млекопитающих имеет домен, наделенный АТФазной активностью, тогда как другой домен имеет структурную функцию (формирование толстых филаментов) (17).Дифтерийный токсин представляет собой мономер, аминоконцевая часть которого рибозилирует фактор элонгации млекопитающих, тогда как С-концевая часть отвечает за перенос каталитической части через мембрану (18). Репрессор биотина представляет собой очень интересный бифункциональный белок из 321 аминокислотного остатка, который действует на двух разных уровнях. В дополнение к своей репрессорной функции он обладает активностью ацетил-КоА-карбоксилазы и холоферментсинтетазы (19).

3. Некаталитические функции могут быть сплавлены

Сывороточные альбумины человека и крупного рогатого скота состоят из трех гомологичных доменов.Они наделены независимыми связывающими и транспортными функциями для триптофана, билирубина и длинноцепочечных жирных кислот (20). Репрессор Lac, гомотетрамер, имеет два независимых домена: небольшой N-концевой домен, который распознает соответствующую операторную ДНК, и ядро, которое связывает индуктор. Аминоконцевая часть конститутивного мономера обеспечивает сборку тетрамеров (21). Другие репрессоры также имеют отдельные домены для связывания лиганда и для специфического связывания ДНК. Иммуноглобулины млекопитающих имеют отдельные сайты связывания антигена и фиксации комплемента (22).

4. Структурные доказательства многофункционального белка

1. В одной полипептидной цепи должно быть более одной функции.

2. Автономность этих функций должна быть продемонстрирована наличием различных доменов в этой полипептидной цепи. Генетический анализ может дать доказательства, если удастся выделить мутантов, дефектных только по одной функции. Одноточечные мутации могут привести к потере более чем одной функции.Однако в этом случае следует исключить плейотропные эффекты. Убедительные доказательства могут быть получены путем построения подробной генетической карты, как это сделано для нескольких ферментов E. coli ((23), (24)).

3. Методом, дающим убедительные доказательства, является выделение и характеристика фрагментов, которые сохранили свою индивидуальную функцию неповрежденной. N-концевой домен может быть получен и выделен с использованием нонсенс-мутантов. Ограниченный протеолиз также полезен, потому что шарнирный пептид, который связывает отдельные домены, часто очень чувствителен к протеолитической атаке (25).

4. Химическая модификация может влиять на одну функцию, не затрагивая другую. Например, активность аспартаткиназы I E. coli разрушается при обработке фермента сульфгидрильными реагентами, в то время как другая каталитическая активность бифункционального белка, гомосериндегидрогеназы, остается неизменной (26).

Подходящими физическими методами являются ультрацентрифугирование , гель-фильтрация и электрофорез в ПААГ с денатурирующими агентами и без них для определения молекулярной массы нативного белка и числа его субъединиц.Изоэлектрофокусировка может косвенно свидетельствовать об идентичности субъединиц. Количество автономных функций должно превышать количество разделяемых белковых полос. Белковая полоса должна быть однородной. Окончательное доказательство, очевидно, обеспечивается полной последовательностью белка или кодирующего гена (кДНК в случае эукариот).

Чрезвычайно многофункциональные белки, идентифицированные из сети взаимодействия белков человека

Принцип вывода для ЭМП

Ожидается, что многофункциональные белки будут выполнять свои различные функции через разных партнеров по взаимодействию.Поэтому нам необходимо идентифицировать белки на пересечении наборов функционально родственных белков. Во-первых, наборы перекрывающихся белков были идентифицированы в интерактоме человека с использованием генератора перекрывающихся кластеров (OCG) 13 , алгоритма, который покрывает сеть системой перекрывающихся кластеров. Эти кластеры образованы сильно взаимосвязанными белками, которые, как правило, участвуют в одних и тех же клеточных процессах и могут включать белковые комплексы. Мы выбрали OCG, потому что, как мы ранее продемонстрировали 13 , он особенно хорошо подходит для обнаружения многофункциональных белков и работает лучше, чем другие алгоритмы на разреженных графах, таких как сети PPI.Во-вторых, клеточные процессы, в которые вовлечены кластеры, были идентифицированы на основе аннотаций составляющих их белков BP Gene Ontology (GO) 14 : термины GO, аннотирующие не менее 50% белков кластера, относятся к кластеру. , который теперь можно назвать «функциональным модулем». Затем каждый отдельный белок наследует аннотации своего модуля (модулей) в дополнение к своим собственным. Эта процедура аннотирования способствует обнаружению функционально однородных кластеров, которые с большей вероятностью представляют собой функциональные модули, и максимизирует количество успешно аннотированных кластеров.Наконец, чтобы отличить экстремальные многофункциональные белки от «классических», были идентифицированы белки, обнаруженные на пересечении функциональных модулей, аннотированных к непохожим функциям .

Функция (нес)сходство определяется двумя показателями ассоциации терминов GO (доступны в базе данных Pronto; см. Методы и (http://tagc.univ-mrs.fr/pronto)) на основе частоты ко- появление пары терминов GO либо в аннотации белка, либо в паре аннотаций взаимодействующего партнера.Использование этих метрик гарантирует, что множественные функции, в которых участвует белок-кандидат, очень редко выполняются (i) одним белком и (ii) взаимодействующими белками, двумя прокси, которые мы считаем индикаторами несвязанных функций . Наш конвейер (MoonGO) более подробно описан в разделе «Методы» и обобщен на рис. 1.

Рисунок 1: MoonGO: конвейер идентификации ЭМП.

Перекрывающиеся кластеры извлекаются из сети PPI с помощью OCG.Кластеры аннотируются в соответствии с аннотациями GO составляющих их белков. Затем потенциальные ЭМП идентифицируются на пересечении кластеров, участвующих в несвязанных биологических процессах, в соответствии с вероятностями ассоциации терминов ProOnto GO.

Набор из 430 кандидатов EMF

Мы применили наш конвейер к большому высококачественному человеческому интерактому (74 388 взаимодействий между 12 865 узлами, дополнительные данные 1), построенному путем извлечения данных из онлайн-баз данных (см. Методы).855 перекрывающихся кластеров, возвращенных OCG, содержали в среднем 33,4 белка. Из них один или несколько БП были отнесены к 633 (74%) на основании аннотации составляющих их белков (дополнительные данные 2). Все сетевые белки принадлежали хотя бы к одному аннотированному кластеру. Как и ожидалось из предыдущего анализа, около трети интерактома (3846 белков, 29%) принадлежат к нескольким кластерам и поэтому могут считаться многофункциональными 13 . Из них 430 белков (10%) обнаруживаются на пересечении кластеров, аннотированных с разными функциями, и считаются кандидатами на ЭМП (дополнительные данные 3).

Поскольку кандидаты определяются по аннотациям их модулей, их идентификация зависит от качества этих аннотаций. Указанное качество оценивали путем проведения трех типов тестов рандомизации. Во-первых, аннотации всех белков были перемешаны, и кандидаты были идентифицированы с использованием этих рандомизированных аннотаций. Более 100 испытаний, в среднем только 104,78 из 855 кластеров были аннотированы по сравнению с 633 для реальных данных, демонстрируя, что такое большое количество функционально однородных кластеров не может быть найдено случайно.Следовательно, количество идентифицированных кандидатов в этих условиях заметно уменьшилось (7,55 против 430 для реальных данных). Во-вторых, топология сети была рандомизирована путем рисования случайных ребер между узлами. Как и ожидалось, поскольку это разрушает модульную структуру сети, кандидатов практически не нашлось. Процесс повторялся десять раз, и в среднем было выявлено только 0,4 кандидата, что ясно показывает, что наши результаты нельзя найти в случайной сети. В-третьих, топология была рандомизирована при сохранении того же распределения степеней.Другими словами, количество узлов с заданной степенью было одинаковым, но какой узел имел какую степень, было рандомизировано. Процесс был повторен десять раз, и наш пайплайн был применен к этим рандомизированным сетям. Как и ожидалось, мы не нашли почти никаких результатов: в среднем было идентифицировано всего 26,8 кандидата в EMF.

Идентификация кандидатов также зависит от вероятностей аннотаций, устанавливающих функциональное различие модулей. Поэтому мы пересчитали количество кандидатов при перетасовке вероятностей ассоциации между парами терминов GO.В среднем за 100 прогонов было выявлено 1,03 кандидата, что еще раз указывает на то, что наши результаты не могут быть получены случайно.

Обоснованность функционального модульного подхода была подтверждена путем демонстрации того, что термины GO, которые привели к обнаружению кандидатов, не входят в число их существующих аннотаций, а были добавлены в процессе наследования аннотаций в зависимости от их принадлежности к модулю. Действительно, только 71 кандидат (17%) уже был аннотирован к обоим терминам, используемым для их идентификации, 209 (51%) были аннотированы к одному термину и унаследовали другой из аннотаций своих модулей, тогда как 128 (31%) не были аннотированы к любой термин, поэтому оба термина наследуются от их модулей.Это еще раз подтвердило возможности сетевого анализа взаимодействия для прогнозирования функций.

Наконец, качество предполагаемых аннотаций было оценено с использованием подхода исключения. Для каждого из идентифицированных кластеров мы удалили одну из аннотаций его белков, аннотировали кластер и сделали вывод о аннотациях кластера к белку. При этом мы правильно назначаем по крайней мере одну из известных аннотаций в 62,6% случаев, что указывает на то, что наш подход способен спасти известные белковые аннотации, следовательно, предполагается, что новые аннотации, которые мы выводим, заслуживают доверия.

Поскольку MP являются подмножеством EMF, мы составили список из 39 известных человеческих MP из литературы и проверили, были ли они найдены в качестве кандидатов. Шесть из тридцати девяти принадлежали разнородным модулям и были найдены. Хотя обнаружение 6 из 39 при идентификации 430 кандидатов из 12 865 представляет собой обогащение в 4,6 раза по сравнению с ожидаемым, со значительным значением P (1,4e −3 , гипергеометрическое), 6 из оставшихся 33 не смогли быть найдены MoonGO, поскольку они принадлежали к кластерам, которые не могли быть аннотированы.Таким образом, мы не можем исключить, что оставшиеся 27 белков были упущены из-за плохо аннотированных кластеров или потому, что все их взаимодействия еще не обнаружены. В целом эти разные оценки подтвердили специфичность нашего подхода и укрепили нашу уверенность в выявленных кандидатах.

Кандидаты были найдены для связывания 141 различных парных комбинаций функций между 55 различными терминами GO. Эти пары аннотаций функционально различаются как по аннотации, так и по вероятности взаимодействия (дополнительные данные 4).Было обнаружено, что большинство кандидатов (> 90%) имеют несходные функции, включающие, с одной стороны, связанные с нуклеиновыми кислотами метаболические процессы, а с другой (i) сигнальную активность, (ii) локализацию или (iii) транспорт (см. Таблицу 1 и Дополнительные данные 4).

Таблица 1 Разнородные биологические процессы.

Характеристика кандидатов

Чтобы выяснить, образуют ли кандидаты EMF (Cands) отдельную группу белков по отношению к другим белкам сети, кандидаты были проанализированы для выявления общих тенденций и особенностей, которые их характеризуют (таблица 2).По каждой изучаемой характеристике их сравнивали с несколькими категориями: (i) белки всей сети, (ii) белки, которые принадлежат нескольким кластерам, но не являются кандидатами, поскольку эти кластеры не аннотированы существенно отличающимися терминами GO (Multi-non-candidate). (NC)), (iii) все многокластерные белки (Multi), (iv) белки, принадлежащие одному кластеру (Mono), (v) все белки NC и (vi) сетевые концентраторы, определяемые здесь как те узлы, степень которых равна как минимум в два раза выше среднего по сети (⩾25).Обратите внимание, что эти категории не являются взаимоисключающими. Поскольку кандидаты определяются как те белки, которые находятся на пересечении модулей, аннотированных разнородными терминами, все они по определению мультикластерны. Следовательно, чтобы идентифицировать характеристики, общие для EMF, которые отличают их от других многофункциональных белков, необходимо найти черты, общие для кандидатов, но не для Multi-NC.

Таблица 2 Возможности-кандидаты.

Топологические характеристики сети-кандидата

Кандидаты имеют значительно более высокую степень, чем Multi-NC.В среднем они взаимодействуют с 74,6 белками по сравнению с 21,9 для Multi-NC (критерий Уилкоксона P — значение = 1,27e-96; рис. 2a). Следовательно, они принадлежат к большему количеству сетевых кластеров (среднее значение Cands (15,2) по сравнению с Multi-NC (3,8), тест Уилкоксона P — значение = 1,15e-150; дополнительный рис. 1) и занимают значительно более центральное место в сети, чем Multi-NC. NC (среднее Cands (235 005,6) по сравнению с Multi-NC (46 177,2), тест Уилкоксона P — значение = 1,44e-112), как показано их промежуточными баллами (дополнительный рисунок.2), мера того, насколько данный узел занимает центральное место в сети, рассчитывается путем количественной оценки того, сколько раз узел действует как мост на кратчайшем пути между двумя другими узлами. Неудивительно, что кандидаты также более связаны друг с другом в соответствии с анализом кратчайшего пути, чем Multi-NC (дополнительная рис. 3).

Рис. 2: Характеристики белка.

( a ) Белковая степень. ( b ) Белковые изоформы. ( c ) Число доменов Pfam (включая PfamB), предсказанное для каждого белка.( d ) Нарушение белков, рассчитанное disopred. Показанные числа представляют собой процент неупорядоченных остатков белка. Выбросы не показаны. Красные точки обозначают средние значения, а верблюжьи точки между кандидатами и концентраторами — это значения известных подрабатывающих белков.

Обратите внимание, что, хотя кандидаты имеют тенденцию быть более подключенными, чем концентраторы (среднее значение Cands (74,6) по сравнению с концентраторами (55,5)) не все кандидаты имеют высокую степень (см. рис. 2a), и только 20% сетевых концентраторов были найдены в качестве кандидатов, демонстрируя, что высокая степень не является ни необходимой, ни достаточной для рассмотрения в качестве кандидата.. Поэтому возможно, что многочисленные функции наших кандидатов на самом деле выполняются разными изоформами одного и того же гена. Однако кандидаты не имеют значительно больше изоформ, чем Multi-NC (среднее Cands (2,2) по сравнению с Multi-NC (2.1), критерий Уилкоксона P — значение = 0,2; рис. 2б), что свидетельствует о том, что количество изоформ не является определяющей характеристикой. Как и ожидалось для высокомногофункциональных белков, кандидаты имеют больше доменов, чем Multi-NC (среднее значение кандидатов (3,2) по сравнению с Multi-NC (3,0), критерий Уилкоксона P — значение = 0,0001, рис. 2c). Однако они не намного длиннее (среднее значение Cands (664,7) по сравнению с Multi-NC (614,4), тест Уилкоксона P — значение = 0,09, дополнительный рисунок 4).

Кандидаты также, как и концентраторы, были более консервативны, чем Multi-NC (в среднем Cands (43.7) по сравнению с несколькими NC (42,6), критерий Уилкоксона P — значение = 0,007; см. Методы и дополнительный рисунок 5).

Поскольку структурное нарушение может привести к конформационным изменениям, мы использовали DISOPRED 16 для прогнозирования неупорядоченных остатков и проанализировали как процент неупорядоченных остатков на белок (рис. 2d), так и количество участков последовательных неупорядоченных остатков разной длины (дополнительный рис. 6). Интересно, что хотя кандидаты неотличимы ни от Multi-NC, ни от среднего значения сети, они значительно менее неупорядочены, чем концентраторы (среднее Cands (37.3) по сравнению с концентраторами (40,5), тест Уилкоксона P — значение = 0,028, см. рис. 2d). Эта тенденция была подтверждена результатами десяти других предикторов расстройств, результаты которых были получены из базы данных D2P2 17 (см. Дополнительные рисунки 7–16). Эти результаты позволяют предположить, что, несмотря на их высокую среднюю степень, ЭМП, в отличие от обычных хабов, находятся под более сильным селективным давлением для поддержания стабильной вторичной структуры.

Эукариотические линейные мотивы (ELM) представляют собой короткие отрезки аминокислот, часто расположенные в внутренне неупорядоченных областях, которые, как было показано, помогают направлять белки в определенные субклеточные локализации, определяя состояние модификации белков или регулируя активность белков в контексте зависимым образом 18 .Мы проверили их количество в белках каждой группы, особенно в их неупорядоченных участках. Интересно, что кандидаты обогащены ELM на остаток по сравнению с Multi-NC (среднее Cands (0,0051) по сравнению с Multi-NC (0,0035), критерий Уилкоксона P — значение = 3e-4, рис. 3), тенденция, которая является более выраженным при рассмотрении только ELMS, которые попадают в неупорядоченные области (среднее значение Cands (0,009) по сравнению с Multi-NC (0,006), тест Уилкоксона P — значение = 8e-4, дополнительная рис. 17). Примечательно, что ELM более обогащены среди неупорядоченных остатков в кандидатах (1.В 8 раз, в среднем на неупорядоченный остаток (0,009) по сравнению с общим остатком (0,005), критерий Уилкоксона P — значение = 0,03), чем в Multi-NC (в 1,5 раза, в среднем на неупорядоченный остаток (0,006) по сравнению с общим остатком (0,004), критерий Уилкоксона P — значение = 0,29). Эти результаты показывают, что кандидаты содержат больше ELM, особенно в неупорядоченных областях. В отношении хабов наблюдается такая же тенденция, хотя и не статистически значимая. Таким образом, оказывается, что кандидаты отличаются от хабов содержанием беспорядка и от Multi-NC количеством линейных мотивов на остаток.

Рис. 3: ELM на остаток.

Графики показывают количество ELM, деленное на длину каждого белка.

Наконец, различные группы были также проверены на наличие белков, идентифицированных как содержащие ELM, участвующие в функциональных переключателях, состояние которых в конечном итоге влияет на функцию белка, содержащего ELM (собраны в базе данных switchELM 19 ). Кандидаты демонстрируют 6,2-кратное обогащение такими белками (гипергеометрическое значение P = 1.2e-27), по сравнению с 1,8-кратным среди Multi-NC ( P -значение=2,44e-14), 4,68-кратным для концентраторов ( P -значение=1,07e-62) и истощением моно (в 2,7 раза меньше, P -значение=2e-49). При рассмотрении различных типов функциональных переключателей белки-кандидаты обогащены белками, содержащими бинарные переключающие мотивы (с состоянием ВКЛ/ВЫКЛ), модулируемые аллостерическими эффектами (в 1,6 раза, P -значение = 4,85e-2), по сравнению с Multi-NC и концентраторы, которые не показывают обогащения. Поскольку количество невелико (27 таких белков в интерактоме, 9 из которых являются кандидатами на ЭМП, P -значение = 4.85e-2), мы не можем разумно экстраполировать это наблюдение на полный набор данных EMF. Однако этот конкретный вывод в сочетании с более высокой частотой появления ELM у кандидатов усиливает их функциональную значимость как чрезвычайно многофункциональных и потенциальных MP.

Кандидатные аннотации и выражение

Кандидаты имеют значительно больше аннотаций BP (среднее значение = 16,8, дополнительный рис. 18), чем оба концентратора (среднее значение = 13,0, тест Уилкоксона P -значение = 0,00014) и Multi-NC (среднее значение = 9.3, критерий Уилкоксона P — значение = 1,56e-21), как и ожидалось для белков, участвующих в множественных функциях. Это не вносит смещения в анализ, поскольку только 17% кандидатов уже были аннотированы разнородными парами GO, используемыми для их идентификации в качестве кандидатов (см. «Набор из 430 кандидатов EMF»). Наконец, кандидаты более повсеместно экспрессируются на уровне мРНК (среднее значение = 24,8 тканей, дополнительная рис. 19), чем мульти-NC (среднее значение = 19,8 тканей, тест Уилкоксона P — значение = 5,53e-05), что повышает вероятность что их разные функции могут выполняться в разных тканях.

Кандидат на участие в заболевании

Ожидается, что многофункциональные белки в целом и ЭМП в частности могут быть вовлечены в заболевание, поскольку нарушение их функции может повлиять на многие клеточные процессы. Поэтому мы использовали онлайн-аннотации менделевского наследования у человека (OMIM) 20 , чтобы проверить участие нашего кандидата в заболеваниях человека, и нашли в общей сложности 113 из 430 кандидатов, связанных с 229 различными заболеваниями.

Среди кандидатов наблюдалось 7,6-кратное преобладание белков, ассоциированных с заболеванием (гипергеометрическое значение P = 2.1e-07), но только в 6,2 и 5,8 раз во всех Multis (гипергеометрический P — значение = 9,3e-19) и концентраторах (гипергеометрический P — значение = 0,0003) соответственно. Поскольку белки, участвующие во множественных процессах, с большей вероятностью вызывают заболевание при нарушении, эти результаты подтверждают наше заявление о том, что мультикластерные белки, вероятно, многофункциональны и усиливают различия между кандидатами и концентраторами.

Мы также использовали список из 435 генов рака из ref. 21, чтобы проверить чрезмерное представительство генов, связанных с раком, среди кандидатов.Еще раз мы обнаружили, что они явно перепредставлены (в 3,8 раза, гипергеометрическое P -значение = 6,8e-2) среди кандидатов, тогда как их чрезмерное представительство среди всех Multis (в два раза, гипергеометрическое P -значение = 2,7e- 38) и ступицы (тройные, гипергеометрические P -значение=2.8e-43) менее важны. Это говорит о том, что, хотя все мультикластерные группы белков обогащены раковыми генами, кандидаты снова отличаются от других мультикластерных белков и хабов.

Сигнатура EMF

Сигнатура была построена путем объединения всех протестированных признаков, которые продемонстрировали значительную статистическую разницу между кандидатами и Multi-NC, с одной стороны, и концентраторами, с другой.

Таким образом, наш анализ описывает первый набор характеристик (обобщенных на рис. 4) EMF, который отличает их от других многофункциональных белков. Они, как правило, имеют больше взаимодействующих сторон, принадлежат к большему количеству кластеров, занимают более центральное положение и больше связаны друг с другом в сети; у них также больше аннотаций, больше доменов, они более консервативны и содержат больше линейных мотивов.Они имеют большую тенденцию к вовлечению в заболевание и, как правило, проявляются более повсеместно.

Рисунок 4: Радарные диаграммы.

Радарные диаграммы, показывающие характеристики, которые значительно отличались у кандидатов по отношению к Multi-NC ( a ) и концентраторам ( b ). Средние значения нанесены на график для всех признаков, кроме связи с раком, где показано кратное преобладание. Для кратчайших путей самая внешняя точка данных — это наиболее связанных, то есть имеет наименьшее значение кратчайшего пути.Для всех остальных крайняя точка данных имеет наибольшее значение. Эти графики носят чисто описательный характер и были построены после того, как были найдены кандидаты. Характеристики, которые они описывают, не использовались для идентификации кандидатов.

Другой набор характеристик был определен в отношении концентраторов. Кандидаты, как правило, имеют больше взаимодействующих лиц, занимают более центральное положение в сети, хотя и менее связаны друг с другом, и принадлежат к большему количеству сетевых кластеров. Они с большей вероятностью будут вовлечены в заболевание и имеют больше аннотаций BP.Очень интересно, что они имеют тенденцию быть менее беспорядочными, чем концентраторы, с тем же средним беспорядком, что и сеть.

Чтобы убедиться, что на эти сигнатуры не влияют хорошо изученные белки (такие белки часто имеют искусственно высокую степень в сетях PPI, поскольку их взаимодействия исчерпывающе охарактеризованы), мы повторили анализ на меньшей сети PPI человека, построенной исключительно из крупных белков. двухгибридные данные масштабных дрожжей (сеть CCSB 22 ). Несмотря на гораздо меньший размер этой сети (15 617 взаимодействий между 4494 белками), мы все же могли наблюдать те же глобальные тенденции в 43 кандидатах, найденных нашим пайплайном, для большинства характеристик сигнатур (дополнительные рисунки 20–31).Несмотря на то, что небольшое количество кандидатов удерживало большинство этих наблюдений ниже порога значимости, интересно отметить, что 43 кандидата все еще были значительно менее разупорядочены, чем концентраторы (среднее значение Cands (36,0) по сравнению с концентраторами (47,5), критерий Уилкоксона P ). -значение=0,01). Поскольку эти результаты были получены в сети без предвзятости, они усиливают надежность наших выводов о большом интерактоме.

Примеры кандидатов

Хотя обсуждение каждого из наших кандидатов явно выходит за рамки одной статьи, здесь мы выделяем несколько особенно интересных случаев.Обратите внимание, что аннотации Cellular Component (CC) кластера, показанные ниже, являются только ориентировочными и не использовались при прогнозировании кандидатов.

Рецепторная тирозин-протеинкиназа erbB-2 (ERBB2) является членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста и важным компонентом комплекса нейрегулин-рецептор, который регулирует рост и стабилизацию периферических микротрубочек 23 . Помимо своей сигнальной роли, ERBB2 также является фактором транскрипции, участвующим в транскрипции генов рРНК с помощью РНК Pol I (ref.24). Мы находим ERBB2 на пересечении двух кластеров, один из которых аннотирован как «метаболический процесс соединений азота в клетке» (BP, GO:0034641), родительский термин «транскрипция, ДНК-шаблон», а также «цитозоль» и «ядро» ( CC), другой аннотирован как «передача сигнала» (BP, GO:0007165) и «плазматическая мембрана» (CC). Таким образом, наш метод правильно идентифицировал ERRB2 как EMF и присвоил ему различные и не связанные с ним реальные функции.

Белок RPP40, компонент ядерной рибонуклеазы P, который, как известно, расщепляет 5′-конец молекул тРНК во время их процессинга, был обнаружен на пересечении кластера, аннотированного как «клеточный процесс метаболизма соединений азота» (BP, GO:0034641 ) — родительский термин его добросовестной аннотации «процессинг тРНК» и «ядро» (CC), а другой аннотирован как «передача сигнала» (BP, GO: 0007165), «плазматическая мембрана» и «цитозоль». (CC), предполагая возможную сигнальную роль этого ядерного белка.Интересно, что митохондриальный аналог РНКазы Р выполняет ту же функцию, хотя и образован тремя белками, не связанными на уровне последовательности с ядерной формой. Было высказано предположение, что этот комплекс мтРНКазы P «был построен не просто из компонентов ранее существовавшего нуклеолитического пути, а путем объединения компонентов различных, по существу не связанных между собой биохимических путей» , 25, , что убедительно указывает на возможные совместные функции белков, предназначенных для этого. клеточный процесс.

WBP4 представляет собой белок, ассоциированный со сплайсосомой, который способствует сплайсингу пре-мРНК. Он находится на пересечении кластера, аннотированного как «сплайсинг РНК посредством реакций переэтерификации с выпуклым аденозином в качестве нуклеофила» (BP, GO:0000377) и «нуклеоплазмы» (CC), что соответствует его известной функции, и еще один аннотированный на «ответ на эндогенный стимул» (BP, GO:0009719) и «цитозоль», «часть нуклеоплазмы» и «внутриклеточную немембранно-связанную органеллу» (CC), что предполагает новую роль этого белка.Хотя на сегодняшний день не было показано никакого участия в сигнальном пути, белок содержит два WW домена, способных взаимодействовать с пролин- или фосфосерин-фосфотреонин-содержащими мотивами и, как известно, опосредует регуляторные взаимодействия в различных сигнальных путях, таких как Hippo 26 .

MoonDB

Мы собрали наши результаты в MoonDB, базе данных, которая включает в себя 39 человеческих MP, использованных здесь, а также полный список кандидатов EMF. Для всех белков MoonDB обеспечивает легкий доступ к разнообразной информации (последовательность, организация домена, функциональные аннотации, участие в заболевании и т. д.).Кроме того, для идентифицированных здесь кандидатов приведены сведения о функциональных модулях из графа и функциональной несхожести пар ГО, что позволило их идентифицировать. MoonDB доступен по адресу http://tagc.univ-mrs.fr/MoonDB.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Многофункциональные белки: участие в заболеваниях человека и цели современных лекарств

Белки-совместители и болезни человека

Первый проведенный анализ должен был выяснить, сколько белков-совместителей связано с известными человеческими заболеваниями.Исчерпывающий анализ литературы, связанной с заболеваниями, связанными с человеческими многозадачными белками в MultitaskProtDB-II (таблица S1), показывает, что 78% подрабатывающих белков в MultitaskProtDB-II связаны с заболеваниями. Эти белки с описанием их функций и заболеваний, в которые они вовлечены, можно увидеть в таблице S2.

Количество белков человека, указанных как проверенные записи в базе данных UniProt, составляет 20 168 во время исследования. С одной стороны, из базы данных OMIM мы увидели, что только 3600 из этих белков связаны с заболеваниями человека.Этот результат явно значителен, как видно из таблицы S4, и составляет 17,85%. С другой стороны, с помощью опубликованной MultitaskProtDBII, которую можно найти в таблице S1, был создан набор определяемых в настоящее время белков совмещения человека. Как и прежде, мы проверили в OMIM и в литературе, связаны ли эти белки с заболеваниями человека, и было обнаружено неожиданное число, которое показывает, что 78% проанализированных белков участвуют в заболеваниях человека. Этот процент намного выше, чем 17.85% содержится в белках человека в целом. Вероятности того, что человеческий белок-UniProt и человеческий белок-MultitaskProtDB вовлечены в известное OMIM-заболевание, рассчитывали с использованием отношения ODD. В целом, эти результаты предполагают, что совместные белки склонны участвовать в заболеваниях человека, на что указывают соответствующие коэффициенты ODD; 16,47 (ДИ 95% 10,95–25,44) в анализе OMIM, что является очень значимым (значение точного критерия Фишера; p < 2,2e-16) (см. таблицу S6).

Некоторые соответствующие примеры подрабатывающих белков, которые участвуют в заболеваниях человека, можно увидеть в таблице 1.Они были идентифицированы после скрещивания данных OMIM и HGMD. Эти примеры были выбраны для демонстрации случаев, в которых фенотип можно легко отнести к одной из биологических функций белка. Жирным шрифтом выделены предполагаемые функции, связанные с болезнями: (С) для тех болезней, которые связаны с канонической функцией, и (М) для тех, которые связаны с функцией подработки. Есть несколько примеров, когда каждая функция связана с отдельным заболеванием (например, фумаратгидратаза).Иногда трудно выяснить, какая функция отвечает за заболевание, предполагая, что обе функции могут способствовать возникновению различных симптомов (например, белок Hes1). Огромный список всего набора из 112 белков-совместителей, которые участвуют в заболеваниях человека, можно найти в таблице S2. На рис. 2A1 можно увидеть круговую диаграмму, показывающую процент подрабатывающих белков, классифицированных по типу заболевания. Эти результаты можно сравнить с рис. 2А2, на котором показаны те же данные, но относящиеся ко всему набору белков человека, участвующих в заболеваниях, согласно Uniprot [24].Две недавние работы, принадлежащие группе Бруна, предсказывают, что 3% интерактома человека соответствуют белкам, работающим по совместительству. Они также говорят, что эти белки в значительной степени вовлечены более чем в одно заболевание или сопутствующие заболевания [19, 31]. Четырнадцать из их набора предсказанных белков-совместителей человека можно найти в нашем списке белков-совместителей, участвующих в заболеваниях человека (таблица S2). Следует учитывать, что наш список состоял только из экспериментально продемонстрированных многозадачных белков, в то время как ряд белков-совместителей исследований группы Бруна соответствует предсказанным белкам-совместителям [32].Приведенные выше результаты подразумевают, что человеческие белки, работающие по совместительству, в значительной степени связаны с болезнями человека по сравнению с белками, не работающими по совместительству.

Таблица 1 Примеры подрабатывающих белков, участвующих в заболеваниях человека и мишенях для лекарств

Предсказание предполагаемых новых белков-кандидатов на подработку с использованием OMIM

В общем, подрабатывающие белки выявляются экспериментально по счастливой случайности. Таким образом, насколько это возможно, было бы очень интересно идентифицировать их биоинформационно.Несколько попыток биоинформатического предсказания многозадачных белков были предложены группами Бруна [19, 32], Кихары [33, 34, 35] и нашими [27, 28, 35, 36, 37]. Один интересный вопрос, который возник у нас, заключается в том, могут ли базы данных о генетических заболеваниях человека, такие как OMIM, быть полезным ресурсом для поиска подрабатывающих белков. Началась ручная проверка баз данных болезней человека, чтобы выявить некоторые предполагаемые подрабатывающие белки и, кроме того, попытаться предположить молекулярную основу связанного с ними заболевания.В таблице 2 показаны некоторые примеры предсказаний предполагаемых белков, работающих по совместительству, присутствующих в базе данных OMIM. Следует учитывать, что данные баз данных белок-белковых взаимодействий (PPI) и использование инструмента сравнения структур PiSite могут помочь в объяснении неожиданной связи с канонической/совместной функцией и ассоциированным заболеванием. Например, в случае с белком группы J анемии Фанкони (Q9BX63) поиск в базе данных PPI показывает, что этот белок взаимодействует с белками репарации ДНК, а также с белком рака молочной железы BRC1.Другим примером является кальций-независимая фосфолипаза A2 (O60733), в которой каноническая функция белка связана с метаболизмом жирных кислот, но, по-видимому, он также участвует в нейродегенеративных заболеваниях головного мозга. Более того, анализ PPI показывает связь между этим белком и BAG, белком, участвующим в апоптозе и выживании клеток. Более того, с помощью PiSite мы обнаружили, структура которого аналогична каспазе-2 белка апоптоза. Дополнительные примеры того, как совместные белки могут быть предсказаны с использованием баз данных заболеваний, а также структурного и интерактомного анализа, показаны в таблице 2.

Таблица 2. Примеры предсказанных белков совмещения человека и связанных с ними генетических заболеваний

Интригующий вопрос заключается в том, могут ли мутанты партнеров по взаимодействию связанного с болезнью подрабатывающего белка также быть причиной такой же или, по крайней мере, очень похожей патологии. Эта идея сильно подкрепляет причастность этих мутантов к недугу. Что касается этой проблемы, в таблице 2 есть несколько примеров, таких как 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназа.Этот белок участвует в расстройстве умственной отсталости, а его партнер по взаимодействию, мутантный белок бета-амилоида A4, участвует в двух церебральных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и церебральная ангиопатия. Кроме того, как упоминалось в предыдущем абзаце, взаимодействие фосфолипазы А2 с BRC1 является хорошим примером того, что два мутанта-партнера вызывают то же заболевание, что и предполагаемый белок-совместитель. В противном случае могут быть обнаружены партнеры по взаимодействию, участвующие в различных заболеваниях, что позволяет предположить, что предсказанный подрабатывающий белок может участвовать в другом, еще не связанном с ним заболевании.Примером этого случая является альфа-аминоадипиновая полуальдегидсинтаза (Q9UDR5), которая представляет собой двух связанных с раком партнеров по взаимодействию: протоонкогенный белок Myc и фактор связывания теломерных повторов 2.

Подводя итог, можно сказать, что предсказание белков-совместителей с использованием баз данных OMIM и HGMD может улучшить наши знания на молекулярном уровне о клинических основах ряда заболеваний. Дальнейшее применение всех этих исследований может помочь пересмотреть и переосмыслить некоторые фенотипы заболеваний человека, создав новые терапевтические стратегии.Более того, некоторые побочные эффекты лекарств можно объяснить [38].

Ряд подрабатывающих белков являются мишенями для лекарств

Современные человеческие клиники требуют определения молекулярной основы болезни и разработки надлежащей терапии для нее. В большинстве случаев терапевтический процесс требует применения лекарственных препаратов в качестве основного или дополнительного лечения. Мы проверили, в какой степени подрабатывающие белки человека являются известными мишенями современных лекарств (которые представляют собой небольшой и предвзятый набор потенциальной вселенной генома, пригодного для употребления наркотиков) [39].

Любопытно, что 48% белков-подработчиков человека являются текущими мишенями для лекарств, в то время как только 9,8% белков человека, присутствующих в UniProt, определены как мишени для лекарств. Эти расчеты были выполнены, как описано в параграфе «Подрабатывающие белки и болезни человека», но здесь мы приняли во внимание 1969 белков человека, являющихся мишенями для лекарств, представленных в базах данных TTD и DrugBank [22, 23]. Этот результат снова явно значим, как видно из таблицы S5.Кроме того, вероятности того, что человеческий белок -UniProt- и человеческий белок -MultitaskProtDB- являются лекарственными мишенями, перечисленными в базах данных TTD и DrugBank, были рассчитаны с использованием коэффициента ODD, наблюдая повышенное соотношение доли белков, используемых в лекарствах, 8,49 (ДИ 95%). 5,99–12,00) в подгруппе совместителей, поскольку эта разница очень значительна (значение точного критерия Фишера; p < 2,2e-16) (см. Таблицу S6).

Эти расчеты и приведенные выше проценты подчеркивают интерес к подрабатывающим белкам для понимания молекулярных основ генетических заболеваний и для рационального дизайна лекарств после идентификации цели.

В последнем столбце Таблицы 1 некоторые примеры этих родственных текущих препаратов можно увидеть, перейдя по соответствующей ссылке. В таблице S3 указан весь набор из 68 подрабатывающих белков, которые в настоящее время идентифицируются как мишени для лекарств, с соответствующими ссылками на базы данных о болезнях человека и лекарствах. На рисунке 2B1 показана круговая диаграмма с процентным содержанием подрабатывающих белков, которые являются мишенями для лекарств, классифицированных по функциональным классам. Эти результаты можно сравнить с рис.2B2, на котором показаны те же данные, но относящиеся ко всему набору белков человека, которые в настоящее время являются лекарственными мишенями, согласно базе данных DrugBank [23]. Учитывая, что многие болезни связаны с подрабатывающими белками, то же самое должно быть и с мишенями белковых препаратов. Тем не менее, это не должно быть так просто, как кажется. «Поддающийся лечению» не означает быть мишенью для лекарств, потому что мишенями для текущих лекарств являются только успешные случаи [40]. Более того, хорошо известно, что существует множество немедикаментозных мишеней.Следует учитывать, что Drews [39] оценил количество потенциальных мишеней для лекарств от 5000 до 10000.

Эти две заявленные категории, вовлеченность в заболевания человека и мишени для лекарств, не кажутся взаимоисключающими, но в нашем анализе мы использовали данные из баз данных TDT и DrugBank, которые считаются истинными мишенями для лекарств. Однако в этих базах данных может быть информация о нескольких скрытых мишенях, как для некоторых конкретных белков, так и для целых биохимических путей.Верно также и то, что ряд лекарств могут воздействовать на белки, которые, насколько известно на современном уровне техники, не участвуют непосредственно в заболеваниях, тем самым способствуя таким механизмам, как полифармакология, нецелевые эффекты и т. д. В некоторых случаях эти белки не поддаются лечению, потому что они вовлечены в такое количество путей, что действие предполагаемого лекарства может быть даже пагубным. Биохимические и фармакокинетические/фармакодинамические механизмы, вовлеченные в эти ситуации, часто раскрываются в ходе дальнейших более глубоких исследований.Сетевая фармакология — это область, которая в настоящее время стремительно развивается, и, по сути, описанная здесь процедура картирования различных заболеваний и предполагаемых мишеней в белке может способствовать пониманию вопроса, поднятого рецензентом. Например, раскрытие подрабатывающей функции может предложить новые биохимические пути, связанные с болезнью, которые ранее были скрыты.

То, что 48% белков-совместителей человека являются мишенями для лекарств, а также тот факт, что 78% генов OMIM соответствуют белкам-совместителям, подтверждает мнение многих авторов о том, что совместительство не является редким явлением и, следовательно, многие белки человека была бы многозадачность.В предыдущем абзаце была предложена проверка баз данных генов болезней для выявления многозадачных белков, и мы также предлагаем добычу белков по совместительству для скрининга лекарств. Один интересный вопрос заключается в том, могут ли базы данных генетических заболеваний человека, такие как OMIM, быть полезным ресурсом для поиска подрабатывающих белков и связаны ли они с патологиями.

Сопоставление канонической и подрабатывающей функций

Как правило, об открытии подрабатывающего белка сообщается без привязки каждой функции к конкретному домену белка.Даже один из лучших подрабатывающих белков, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, не был функционально картирован (за исключением его канонической функции). Поэтому было бы очень полезно локализовать каждую функцию, насколько это возможно, в последовательности/структуре белка.

В нашей предыдущей работе по биоинформационному предсказанию многозадачных белков мы предложили использовать некоторые программы моделирования для назначения конкретных областей в структуре, если эта информация доступна [27, 28].Метод, который был предложен для сопоставления канонической и совместной функций в структуре белка (см. раздел «Материалы и методы»), был применен к совместительному белку фумараза-гидратазе в качестве примера (белок представлен в таблице 1). Этот белок связан с дефицитом фумаразы (FD) и наследственным лейомиоматозом плюс почечно-клеточный рак (HLRCC). База данных UniProt сообщает о белковых мутациях, связанных с этими заболеваниями. На рисунке 3 показана трехмерная структура тетрамера, а также мутации, связанные с FD и HLRCC, которые показаны красным и синим цветом соответственно.Желтым цветом выделены мутации, связанные с обоими заболеваниями. На этой картинке ясно видно, что каноническая функция , связанная с FD, находится в центре тетрамера, а подрабатывающая функция , связанная с HLRCC, находится в другой области белка. Структура и аминокислотные мутанты убедительно указывают на молекулярную основу заболевания, потому что эти мутации, по-видимому, нарушают взаимодействие и образование правильного тетрамера, который, в свою очередь, может косвенно, в определенной степени, изменять точное расположение аминокислот в молекуле. активный центр, снижая его активность.

Рис. 3

Структура тетрамера фумаратгидратазы человека (P07954). Этот белок вызывает два сопутствующих заболевания: дефицит фумаразы (FD) и наследственный лейомиоматоз плюс почечно-клеточный рак (HLRCC). Красным отмечены мутации, связанные с FD, а синим — мутации, связанные с HLRCC. Мутации, связанные с обоими заболеваниями, отмечены желтым цветом

Как показано в приведенных выше примерах, отображение каждой функции на трехмерной структуре многозадачного белка может быть полезным для понимания его нормальных и патологических функций.

Многофункциональные РНК-связывающие белки влияют на количество мРНК и эффективность трансляции отдельных наборов генов-мишеней

Abstract

РНК-связывающие белки (RBP) могут регулировать более чем один аспект метаболизма РНК. Мы искали такую ​​ранее не обнаруженную многофункциональность в наборе из 143 RBP, определив прогностическую ценность количества RBP для уровней транскрипции и трансляции известных генов-мишеней RBP в 80 человеческих сердцах.Это привело нас к новой ассоциации 27 RBP с сердечной трансляционной регуляцией in vivo . Из них 21 влиял как на экспрессию РНК, так и на трансляцию, хотя и для практически независимых наборов генов-мишеней. Мы выделяем их подмножество, включая G3BP1, PUM1, UCHL5 и DDX3X, где двойная регуляция достигается за счет дифференциальной аффинности к длине мишени, с помощью которой контролируются отдельные биологические процессы. Как и РНК-хеликаза DDX3X, известные факторы сплайсинга EFTUD2 и PRPF8 — все идентифицированные в нашем анализе как многофункциональные RBP — избирательно влияют на скорость трансляции мишени в зависимости от структуры 5’UTR.Наши анализы идентифицируют десятки RBP как многофункциональные и указывают на потенциальные новые регуляторы трансляции, постулируя непредвиденную сложность взаимодействий белок-РНК на последовательных стадиях генной экспрессии.

Резюме автора

Жизненный цикл молекулы РНК контролируется сотнями белков, которые могут связывать РНК, также известных как РНК-связывающие белки (RBP). Эти белки распознают участки посадки в РНК и направляют транскрипцию РНК из ДНК, ее процессинг в зрелую информационную РНК, ее трансляцию в белок или ее деградацию, когда РНК больше не нужна.Хотя теперь мы механистически понимаем, как определенные RBP регулируют эти процессы, для многих взаимодействий RBP-мишень последствия, налагаемые связыванием РНК, недостаточно понятны. Для 143 RBP с известными положениями связывания РНК авторы текущего исследования изучили, как молекулы РНК реагировали на колебания уровней экспрессии этих RBP в каждом из 80 человеческих сердец. Используя статистические подходы, они смогли показать, что многие RBP влияют на этапы жизненного цикла РНК, в которых они, как известно, не участвовали.Некоторые RBP оказались настоящими «универсалами» в метаболизме РНК: они контролировали уровни транскриптов РНК одних генов, в то время как они влияли на скорость трансляции других. Эта неожиданная многофункциональность раскрыла ранее скрытые аспекты повседневной жизни РНК-связывающего белка.

Образец цитирования: Schneider-Lunitz V, Ruiz-Orera J, Hubner N, van Heesch S (2021) Многофункциональные РНК-связывающие белки влияют на количество мРНК и эффективность трансляции различных наборов генов-мишеней.PLoS Comput Biol 17(12): е1009658. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658

Редактор: Грег Такер-Келлог, Национальный университет Сингапура, СИНГАПУР

Получено: 2 августа 2021 г.; Принято: 18 ноября 2021 г .; Опубликовано: 8 декабря 2021 г.

Авторское право: © 2021 Schneider-Lunitz et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Это исследование не включает новые сгенерированные данные, хранящиеся во внешних репозиториях. Номера доступа для всех данных, использованных в этом исследовании, указаны в разделе «Материалы и методы» со ссылкой на исследования, в которых были получены и опубликованы данные. Все сценарии, созданные для анализа, доступны через платформу разработки GitHub по адресу: https://github.com/vschnei/Dual-function_RBP_manuscript_analysis.

Финансирование: Эта работа была поддержана исследовательской и инновационной программой Horizon 2020 Европейского Союза [предварительный грант Европейского исследовательского совета (ERC), соглашение о предоставлении гранта № AdG788970 для N.ЧАС.; https://erc.europa.eu]; Фонд Leducq [11 CVD-01 для NH; https://www.fondationleducq.org]; и «Bundesministerium für Bildung und Forschung» [предоставить карнацию NH; https://www.dfg.de]. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Взаимодействия РНК-белок имеют решающее значение для широкого спектра процессов во многих субклеточных компартментах, включая транскрипцию РНК, сплайсинг, редактирование, транспорт, стабильность, локализацию и трансляцию [1].Используя современные подходы, основанные на масс-спектрометрии, недавние исследования идентифицировали до тысяч потенциальных РНК-связывающих белков (RBP), хотя для многих их точные роли остаются неизвестными [2-4]. В то время как RBP могут взаимодействовать с РНК-мишенями через четко определенные домены связывания белок-РНК (RBD), часто обнаруживаются нехарактерные RBD [5,6], подчеркивающие сложную, разнообразную и все еще в значительной степени неизвестную природу РНК-белковых взаимодействий. Владение более чем одним RBD теоретически может позволить RBP быть многофункциональными, например, за счет раздельного регулирования различных наборов целей [7].Многофункциональность может быть дополнительно установлена ​​за счет специфичной для состояния или типа клеток экспрессии RBP и их партнеров по взаимодействию, или за счет динамического перемещения RBP между различными субклеточными компартментами, такими как ядро ​​и цитозоль [8-11]. Соответственно, из большого числа RBPs, чья субклеточная локализация была недавно оценена [12], подавляющее большинство может быть обнаружено более чем в одном компартменте, хотя до сих пор в значительной степени неизвестное биологическое значение. Потенциальная важность челночного перемещения RBP была продемонстрирована субклеточным перераспределением десятков RBP при глобальной индукции распада мРНК [13] и специфичными для компартмента изменениями в интерактомах RBP, которые можно наблюдать при клеточном стрессе [14].Эти наблюдения показали, что RBP могут динамически перемещаться, образуя механистический мост между обычно ограниченными компартментами последовательными стадиями регуляции экспрессии генов: некоторые происходят в ядре (например, транскрипция, процессинг мРНК, сплайсинг), другие в цитозоле (например, трансляция). , распад РНК).

RBP являются важнейшими регуляторами трансляции мРНК — синтеза белка из матрицы матричной РНК рибосомами [15]. В цитозоле RBP могут действовать в общем качестве (т.g., инициация трансляции или элонгация мРНК), а также в более специализированных функциях, где избранные вспомогательные RBP или гетерогенные рибосомы облегчают трансляцию выделенных субнаборов РНК-мишеней [16-18]. В ядре RBPs могут координировать процесс сплайсинга и трансляции путем модулирования различных структурных и последовательностных свойств мРНК, которые экспортируются в цитоплазму. Например, высокоструктурированные области в 5′-UTR могут снижать эффективность инициации трансляции за счет общего более низкого результата трансляции [19-22], тогда как увеличенные структуры РНК в CDS или 3′-UTR областях могут также повышать стабильность транскриптов и, следовательно, период полураспада мРНК, что, в свою очередь, приводит к более высокому выходу белка с течением времени [23,24].Кроме того, альтернативное использование UTR может выявлять транслируемые восходящие ORF (uORF) или сайты связывания miRNA, влияющие на трансляцию и/или стабильность мРНК. Другие альтернативные события сплайсинга могут влиять на внутренние свойства мРНК, такие как «быстрота» ядерного экспорта [25], использование кодонов [26, 27], сродство с комплексом экзоновых соединений [28] или восприимчивость к нонсенс-опосредованному распаду. [29].

Механистическое понимание количественных эффектов экспрессии RBP на трансляцию мРНК, т. е. когда скорости трансляции эндогенных мишеней RBP напрямую реагируют на изменения количества RBP, недавно было дано в нескольких исследованиях [30–32].В этих исследованиях эта количественная взаимосвязь использовалась для приписывания новых функций известным RBP и для изучения кинетики, посредством которой RBP регулируют свои мишени. Например, Чотани и др. . использовали подход вычислительной корреляции, чтобы определить частоту, с которой уровни RBP коррелируют с целевыми скоростями трансляции. Это помогло определить ключевые узлы сети RBP, которые имели решающее значение для регуляции трансляции во время сердечного фиброза in vitro и in vivo [30].В отдельном исследовании Луо и др. . использовали основанные на люциферазе анализы связанных функций 3′-UTR для 690 RBP, идентифицировав 50 RBP, экспрессия которых вызывала значительные положительные или отрицательные эффекты на стабильность и/или трансляцию мРНК. Это привело к новой характеристике стрессовой гранулы RBP UBAP2L как связанной с рибосомой RBP [31]. Наконец, Шарма и др. . разработали методологию исследования кинетики РНК-белка с временным разрешением для RBP DAZL [32]. Этот подход помог установить количественную взаимосвязь, которая точно объясняет влияние DAZL на уровни мРНК и ассоциацию рибосом, что коррелирует с кумулятивной вероятностью связывания DAZL в кластерах проксимальных сайтов связывания 3’UTR.

В нашем текущем исследовании мы описываем компьютерную идентификацию предположительно новых, а иногда и двойных функций RBPs в регуляции трансляции мРНК. Мы интегрируем мРНК-мишени, полученные с помощью перекрестной иммунопреципитации (CLIP), для 143 RBP [12,33] с транскриптомами и транслатомами 80 человеческих сердец [34] — ткани, в которой, как известно, трансляционный контроль играет центральную роль в регуляции экспрессии генов [30]. ,34,35]. Мы показываем, что уровни экспрессии многих, но не всех, исследованных RBP действительно коррелируют с численностью мРНК-мишени и/или эффективностью трансляции in vivo .Для подмножества из 21 RBP, включая белки с различными ранее описанными ролями, такие как эндорибонуклеаза G3BP1, геликаза DDX3X, протеаза PUM1 и деубиквитиназа UCHL5, мы смогли независимо определить дозозависимые эффекты как для уровней мРНК, так и для эффективности трансляции в значительной степени отдельные наборы генов-мишеней, каждый из которых участвует в несвязанных биологических процессах. Механически эти гены-мишени также, по-видимому, регулируются независимо, за счет дифференциальной аффинности к длине кодирующей белок последовательности или структуре 5′-UTR.

Наши результаты показывают, что RBP, играющие более чем одну роль в биологии человека, вероятно, будут более распространены, чем ожидается в настоящее время. Мы постулируем, что многофункциональные RBP могут использовать свою функциональную пластичность специфическим для состояния или компартмента образом, чтобы регулировать экспрессию генов на множественных уровнях для отдельно определенных наборов генов-мишеней.

Результаты

Обилие РНК-связывающего белка определяет эффективность трансляции целевого гена

С целью определить, какие RBP могут влиять более чем на одну стадию контроля экспрессии генов, мы сначала определили, может ли количество RBP иметь прогностическое значение для степени регуляции гена-мишени в сердце человека.В связи с этим мы скомпилировали белок-РНК-взаимодействия для 143 RBP, экспрессируемых в сердце, состоящих из RBM20, специфичных для мышц [33], и 142 преимущественно повсеместно экспрессируемых RBP, ранее подробно охарактеризованных как часть ENCODE [12] (см. Methods, S1A Рис и S1 Таблица ). Затем мы сопоставили уровни экспрессии этих 143 RBP с изобилием мРНК и эффективностью трансляции (TE) 11 387 кардиальных экспрессируемых генов в 80 человеческих сердцах — это самый большой набор соответствующих транскриптомов и транслатомов тканей человека, доступный в настоящее время [34].Обилие мРНК измеряли с использованием количества последовательностей РНК, нормализованного для каждого гена и образца, тогда как TE определяли как отношение количества последовательностей Ribo-seq и РНК, нормализованных для каждого отдельного гена и образца (см. Методы). Это выявило четкую количественную связь между уровнями экспрессии RBP и степенью контроля экспрессии гена-мишени (например, скорости трансляции: , рис. 1A, и , S1B, ).

Рис. 1. Содержание РНК-связывающего белка предсказывает целевую регуляцию трансляции.

(A) Схема подхода корреляции RBP-цель. Используя количественные данные Ribo-seq и RNA-seq из 80 сердец, были рассчитаны попарные корреляции RBP с содержанием целевой мРНК или эффективностью трансляции. Показана тепловая карта с иерархически сгруппированными корреляциями Спирмена Rho трансляционной эффективности RBP и транслируемых мРНК в сердце человека. Выделены шесть кластеров корегулируемых RBP (см. также S1 Table ). (B) Тепловая карта с △ баллами Glass, которые количественно определяют размер эффекта наблюдаемой значимости ассоциаций между RBP и содержанием мРНК целевого гена и TE.Показаны только значимые RBP: 37 TE-RBP (оранжевые) и 58 мРНК-RBP (зеленые). Для трех выбранных RBP (по одной на категорию) гистограммы иллюстрируют значимость рассчитанных ассоциаций. (C) Точечный график, показывающий долю трансляционной эффективности корреляций RBP-мишень, которые могут быть воспроизведены в независимом наборе первичных сердечных фибробластов [30]. Для каждого RBP значимость повторения оценивалась путем сравнения доли повторения между наблюдаемыми и рандомизированными наборами, и она представлена ​​​​коричневой (значительной) или красной (незначительной) точкой.Размер точек указывает на силу значимости (-log10 (p adj )) и серые точки соответствуют доле повторяющихся корреляций в рандомизированных выборках. Столбики погрешностей указывают средние значения со стандартным отклонением (SD).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.g001

Затем мы рассчитали частоту, с которой уровни мРНК и эффективность трансляции генов-мишеней, полученных из CLIP, значительно коррелировали с обилием каждого RBP.Для этого мы статистически оценили ассоциации путем выборки 100 000 наборов смоделированных теоретических мишеней одинакового размера из 11 387 транслируемых генов в сердце человека, что дало 58 RBP со значительными ассоциациями (эмпирические p adj ≤ 0,05) с содержанием мРНК-мишени ( далее обозначаемые как «мРНК-RBP», которые регулируют «мРНК-мишени»), и 37 RBP со значительными ассоциациями с эффективностью трансляции мишеней («TE-RBP», регулирующие «TE-мишени») (, рис. 1B, и , S1C, ).Величина эффекта каждой значимой связи была количественно определена с использованием дельта-балла Гласса (△) [36], меры разницы между экспериментальной и смоделированной группами, деленной на стандартное отклонение контроля. Эти важные мишени, например, включали супрессор опухоли-кандидата и вездесущий регулятор сплайсинга RBM5 [37], который мы идентифицировали как сердечную мРНК-RBP, влияющую на количество мРНК по крайней мере 138 коррелирующих мишеней (p adj = 2,83 × 10 — 5 ; Δ стекла’ = 27.2). Обнадеживает, что наша стратегия подтвердила известные TE-RBP, такие как эукариотический фактор инициации трансляции EIF4G2, динамика экспрессии которого может быть связана с эффективностью трансляции генов-мишеней по крайней мере 235 коррелирующих мишеней, экспрессируемых в сердце человека (p adj = 5,26 × 10 ). −5 ; Δ стекла = 6,3) [38,39] (, рис. 1B, ). Важно отметить, что мы смогли воспроизвести наши расчеты для 25 из 37 изображенных TE-RBP в независимой, хотя и меньшей когорте транслатомов первичных сердечных фибробластов (n = 20; фиброз ( фиг.1С ).

Положительный и отрицательный контроль трансляции известными и неизвестными факторами

Мы обнаружили 27 (из 37) TE-RBP без предварительных доказательств регуляции трансляции мРНК, включая 4 RBP, функция которых вообще не связана с их способностью связывания РНК (NKRF, FAM120A, SUB1 и UCHL5) ( S2A Fig ). Чтобы определить, как эти RBP взаимодействуют с существующими сетями RBP для скоординированного регулирования трансляции генов-мишеней, мы иерархически сгруппировали коэффициенты корреляции всех 37 TE-RBP и их целей CLIP.Это в первую очередь разделило матрицу на две отдельные группы TE-RBP с выраженным противоположным влиянием на целевую TE, что свидетельствует о конкуренции и/или сотрудничестве между подмножествами RBP (, рис. 2A, ). Интересно, что представленный метод объединяет известные и новые TE-RBP с противоположной или согласованной направленностью регуляции общих мишеней (, рис. 2B, ). Например, в зависимости от общего гена-мишени, связанного фактором сплайсинга U2AF2 и протеазой UCHL5, могут наблюдаться и независимо реплицироваться совершенно противоположные эффекты на TE ( Figs 2B, S2B и S2C).Более того, коллинеарность RBP не повлияла на большинство общих целей (, рис. 2B, , см. Методы). Хотя эти общие способы регуляции-мишени частично согласовывались с белок-белковыми взаимодействиями, аннотированными в базе данных STRING [40], подмножество корегуляторных «узлов RBP» содержало белки с ранее неизвестным функциональным сходством (например, UCHL5 и U2AF2).

Рис. 2. Анализ CLIP идентифицирует коререгулируемые in vivo мишени новых главных регуляторов трансляции в сердце человека.

(A) Тепловая карта, отображающая иерархически сгруппированные корреляции между уровнями сердечной экспрессии 37 TE-RBP (как определено нормализованной экспрессией Ribo-seq) и сердечной TE 6153 коррелирующих генов-мишеней. Ранее было обнаружено, что каждый из значительно коррелирующих генов-мишеней связан по крайней мере с одним из этих 37 TE-RBP на основе экспериментов CLIP (см. Методы). Кластеризация разделяет две группы с противоположным действием на ТЭ, чьи мишени обогащены метаболизмом мРНК (p adj = 6.соответственно. (B) Дендрограмма с иерархически сгруппированными TE-RBP на основе попарных перекрытий RBP-RBP. Общие гены-мишени всех парных RBP были включены для кластеризации. Нижние тепловые карты с корреляциями эффективности трансляции для выбранных кластеров RBP и общих важных целей. Эти графики иллюстрируют различные кооперативные и конкурентные режимы регулирования RBP-цели.На круговых диаграммах показана доля целей, которые остаются значимыми после поправки на коллинеарность RBP для каждого кластера. Сети белок-белковых взаимодействий STRING [40] из выбранных кластеров RBP обнаруживают функциональную ассоциацию корегулируемых RBP. Цвета ребер и узлов указывают на источники доказательств STRING и известные функции RBP. (C) Тепловая карта с иерархически сгруппированными показателями корреляции Rho Спирмена RBM20 и трансляционной эффективностью предсказанных генов-мишеней.Значимые коррелирующие мишени (n = 163, p adj ≤ 0,05) и мишени, участвующие в мышечном процессе (GO: 0003012), выделены оранжевым и голубым цветами соответственно. Отображается список целевых генов саркомеров, положительно коррелирующих с RBM20 . Выбранные нижние гистограммы иллюстрируют значимость RBM20 с коррелирующими мишенями TE и отсутствие значимости с коррелирующими мишенями мРНК. ( D ) Графики рассеяния, представляющие корреляцию между экспрессией RBM20 (измеряемой нормированным числом Ribo-seq; ось x) и эффективностью трансляции (TE; ось y) двух генов саркомера: TNNI3K и ТТН .Отображается оценка и уровень значимости двух корреляций Спирмена. ( E ) Слева: Диаграмма рассеяния, показывающая корреляцию между нормализованными уровнями экспрессии RBM20 (измеренными с помощью Ribo-seq) и процентом сплайсинга в (PSI) экзона 156 TTN . Справа: Коробчатая диаграмма, сравнивающая среднее значение TTN TE, специфичные для изоформы I-Band, демонстрирующие заметную разницу между TTN изоформой N2B (ENST00000460472), демонстрируя значительно более высокий TE, чем TTN изоформы N2BA (ENST000005

) (критерий суммы рангов Уилкоксона, p-значение = 0.034).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.g002

Среди 27 потенциально новых TE-RBP был специфический для мышц и связанный с дилатационной кардиомиопатией регулятор сплайсинга RBM20, экспрессия которого особенно хорошо коррелировала с TE 163 экспериментально проверенных гена-мишени (из 561 общего числа мишеней; Glass’ Δ = 7,0; , рис. 2C, ). Важно отметить, что уровни RBM20 специфически влияли на TE и не влияли на общее количество или стабильность мРНК.Большинство мишеней RBM20, включая гены саркомера TTN и TNNI3K , положительно коррелировали (т. е. более высокая экспрессия RBM20 связана с увеличением целевого гена TE; Fig 2D ), и особенно те положительно коррелирующие мишени показали сильное обогащение процессов мышечной функции ( GO:0003012, p прил ≤ 5,97 × 10 −16 ) (, рис. 2C ). Чтобы исследовать возможную связь между RBM20-опосредованным сплайсингом мРНК и последующей эффективностью трансляции мРНК, мы оценили, коррелируют ли скорости сплайсинга известных экзонов-мишеней напрямую с TE.Скорость сплайсинга была количественно определена с использованием вычисленных показателей процента сплайсинга (PSI), метрики, которая оценивает эффективность сплайсинга для определенного экзона в популяцию транскриптов гена (см. Методы). Для 66 из 163 (± 40%) трансляционно регулируемых генов-мишеней RBM20 степень альтернативного сплайсинга действительно коррелирует с распространенностью RBM20. Ярким примером является включение экзонов, измеренное в I-диапазоне TTN , чьи экзоны включены только в более длинную изоформу TTN N2BA.Эти экзоны I-диапазона специфически определяют отрицательную корреляцию экспрессии RBM20 с общим TTN TE, указывая на то, что их включение снижает эффективность трансляции TTN . Ранее мы наблюдали, что скорость трансляции TTN сильно зависит от изоформы [34], и теперь можем механически связать это с контролем сплайсинга с помощью RBM20 (, рис. 2E ), следствие, которое кажется обобщаемым для более специфичных для мышц мишеней RBM20, включая другие компоненты саркомера (, рис. 2D, ).Хотя точный механизм, с помощью которого RBM20 влияет на TE, остается неизвестным, этот RBP может не включать экзоны с неэффективной скоростью трансляции кодонов или экзоны, которые влияют на стабильность или структуру транскрипта, оба из которых влияют на скорость синтеза белка [28,41].

Многофункциональные RBP, включая DDX3X и G3BP1, регулируют численность мРНК и эффективность трансляции независимых наборов генов-мишеней

Среди 74 RBP, которые значительно коррелировали с TE целевого гена (37 TE-RBP) или количеством мРНК (58 mRNA-RBP), подмножество из 21 RBP могло быть независимо связано с обоими молекулярными признаками ( рис. 1B и 3A ).Чтобы исследовать, была ли связь с обилием мРНК и TE взаимосвязанной (и, следовательно, последовательной, т. Е. Более высокая экспрессия мишени приводит к увеличению TE), мы исследовали наборы генов, которые значительно коррелировали с любым признаком. Это выявило очень ограниченное перекрытие между коррелирующими генами-мишенями для всех 21 RBP (16,71 ± 8,19%, , рис. 3A, и , таблица S2, ). Чтобы обосновать это наблюдение, мы сравнили характерную для признака силу величин эффекта (опять же, измеренную с помощью Дельты Гласса (△) [36]) и не обнаружили практически никакой связи ( S2 Table ) между корреляциями, независимо наблюдаемыми для оба признака, подтверждая отсутствие эффекта переноса ( рис. 3B и S3A ).Это побудило нас обозначить эти RBP как «многофункциональные RBP» — контекстно-специфические RBP, функциональный результат которых зависит от набора мРНК, на которые они нацелены. Ключевым примером, по-видимому, является многофункциональный RBP DDX3X [42, 43], количество которого значительно коррелирует с уровнями мРНК 339 генов-мишеней (p adj = 2,83 × 10 -5 ; Glass’ Δ = 6,9) и эффективность трансляции 730 генов-мишеней (p adj = 5,25 × 10 -5 ; Glass’ Δ = 11,89), из которых только 43 мишени перекрываются между обоими наборами ( рис. 3A и 3C ).Последствия связывания DDX3X для количества мРНК (положительная корреляция) или TE (отрицательная корреляция) противоположны, хотя это не относится ко всем многофункциональным RBP ( S3B Fig ). Три других многофункциональных RBP аналогичным образом действуют как репрессоры трансляции, оказывая положительное влияние на количество мРНК (DDX6, NKRF, GEMIN5), один RBP демонстрирует прямо противоположное поведение (FAM120A), а все остальные играют согласованные роли на обоих уровнях контроля (например, , TRA2A, FASTKD2, SRSF1).

Рис. 3.Многофункциональные RBP регулируют трансляцию различных наборов генов-мишеней.

(A) Тепловая карта с △ баллами Glass, определяющими размер эффекта свидетельских эффектов для корреляций мРНК и TE. Оба размера эффекта значимы для выделенного набора из 21 многофункциональной RBP. Для этого набора RBP отображаются отдельные диаграммы Венна, представляющие перекрытие общего количества мРНК и мишеней TE . (B) Гистограмма, количественно определяющая величину эффекта мРНК и TE (показатель Гласса △) для многофункциональных RBP.Величина эффекта RBP в значительной степени не зависит от способа регулирования. (C) Избранные гистограммы и точечные графики, иллюстрирующие значимость корреляций RBP-цель и обогащение терминов GO для целей, связанных 4 многофункциональными RBP: DDX3X, G3BP1, PUM1 и UCHL5. Для каждого RBP отображаются 12 наиболее значимых родительских терминов GO. Для трех RBP мишени мРНК и TE демонстрируют различное обогащение значимых терминов GO. (D) Блочные диаграммы с длинами последовательностей транскриптов, 5′-UTR, CDS и 3′-UTR в нуклеотидах для мишеней мРНК и TE, соответствующих четырем выбранным многофункциональным RBP на (C).В общей сложности 9 многофункциональных RBP связывают мишени со значительно различающейся длиной CDS (критерий суммы рангов Уилкоксона). См. также S3, рис. .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.g003

Следует отметить, что гены-мишени TE и мРНК многофункциональных RBP могут быть обогащены для отдельных биологических процессов, что указывает на то, что двойственность может способствовать независимым биологическим результатам. Например, коррелирующие мишени DDX3X и UCHL5 TE кодируют белки, участвующие в сплайсинге РНК (GO:0008380, p adj = 7.70 × 10 -30 ), в то время как их мРНК-мишени не показали какого-либо явного функционального обогащения (, рис. 3C, ). Для G3BP1 мРНК-мишени кодируют белки, участвующие в локализации в ядерном теле (GO: 15, p adj = 5,13 × 10 -12 ), тогда как это не относится к трансляционно регулируемым мишеням, которые обогащены для сплайсинга РНК. (GO:0008380, p прил = 1,61 × 10 −10 ). Такие биологические несоответствия присутствуют не всегда: независимо от способа регуляции оба типа мишеней PUM1 (TE или мРНК), по-видимому, кодируют белки, участвующие в процессинге мРНК (GO:0006397, TE p adj = 2.64 × 10 −22 , мРНК p adj = 6,40 × 10 −13 ).

Дифференциальное сродство многофункциональных RBP к длинам CDS и структурам 5’UTR

Двойная или мультибелковая функциональность может быть достигнута за счет контекстно-зависимых различий в субклеточной локализации [44], партнеров по взаимодействию [45,46] или наличия нескольких РНК-связывающих доменов [47] — все из которых могут точно регулировать или ограничивать подмножество распознанных генов-мишеней. Основываясь на опубликованных доказательствах внутриклеточной локализации RBP, основанных на иммунофлуоресцентной визуализации [12], 13 из 21 многофункциональной RBP действительно одинаково хорошо локализовались как в ядре, так и в цитозоле, что предполагает функциональность в обоих компартментах ( S3 Table ).

Мы дополнительно исследовали относительное положение сайтов связывания CLIP в генах-мишенях (т. е. положение связывания в мРНК: 5′- или 3′-UTR, CDS или интрон). Большинство RBP (включая, например, DDX3X) были рекрутированы в области генов-мишеней в разных пропорциях, но мы не наблюдали заметной разницы в расположении связывания между мишенями мРНК и TE ( S3B Fig ). Однако для SRSF7 и GEMIN5 мишени мРНК и TE были обогащены сайтами связывания интрона и CDS соответственно.Для DDX6 мы наблюдали обогащение мишеней TE сайтами связывания 3’UTR, из которых 87% отрицательно коррелировали с RBP. Недавнее исследование, описывающее анализ привязанной функции для оценки функциональности RBP, обнаружило весьма согласующуюся роль DDX6 в репрессии трансляции, которая напрямую связана с его привлечением к 3’UTR гена-мишени [31]. Это согласуется с ранее описанными репрессивными функциями DDX6 во время трансляции мРНК [48].

Для DDX3X и 10 других RBP мы заметили значительное изменение длины целевого транскрипта, в основном объясняемое различиями в длине целевого CDS, которая немного увеличивалась или уменьшалась между мишенями TE и мРНК (, рис. 3D, и , S3C, ).Наиболее значительные изменения в длине CDS наблюдались для GEMIN5 (уменьшение для TE-мишеней; 2226 нт против 1519 нт; p adj = 3,66 × 10 -9 ), PRPF8 (уменьшение для TE-мишеней; 2243 нт против 2076). nt; p adj = 1,03 × 10 -8 ), DDX3X (уменьшение для целей TE; 1659 нуклеотидов против 1376 нуклеотидов; p adj = 2,81 × 10 -7 ) и G3BP1 (увеличение для целей TE; 1985 против 2798 н., р прил = 6,11 × 10 -5 ).

Наше внимание привлекла геликаза DEAD-box DDX3X, которая регулирует инициацию трансляции путем взаимодействия и последующего распутывания высокоструктурированных последовательностей РНК [49–52].DDX3X связывает 5′-UTR и небольшую рибосомную единицу, чтобы облегчить трансляцию подмножества мРНК с длинными и структурированными лидерными последовательностями [52]. Чтобы определить, могут ли дополнительные RBP требоваться или участвовать в инициации трансляции в мишенях с высокоструктурированными 5′-UTR, мы изучили минимальную свободную энергию 5′-UTR (MFE, нормированная длина) генов-мишеней TE и мРНК, для каждого из многофункциональных RBP. MFE определяет наиболее термодинамически вероятную вторичную структуру для каждой последовательности РНК, при этом более низкие значения MFE указывают на более сложные и структурированные предсказанные конформации.Мы заметили, что между положительно и отрицательно коррелирующими эффективностью трансляции мишени 17 из 21 многофункционального RBP последовательности 5’UTR различались по структурному составу (, рис. 4A, ). Напротив, для достоверно коррелирующих мРНК-мишеней одних и тех же RBP различия были незначительными или почти отсутствовали. Поразительно, но три RBP продемонстрировали самые сильные различия MFE между положительно и отрицательно коррелирующими мишенями: после DDX3X (p adj = 9,47 x 10 -47 ) это были основные сплайсосомные факторы PRPF8 (p adj = 2). .70 x 10 −29 ) и EFTUD2 (p adj = 1,69 x 10 −30 ) ( рис. 4A и 4B ). Цели с положительной и отрицательной корреляцией также демонстрировали незначительные различия в длинах 5’ UTR ( S4A Fig ), но разница в MFE, нормализованная по длине, была намного больше, чем небольшая разница, наблюдаемая в длине UTR, которая поэтому была скорректирована. Более того, эффект MFE все еще был очень значительным после учета длины UTR ( S4B Fig ).Мишени, общие для этих RBP, показали аналогичные направления корреляции с тремя RBP (, рис. 4C, ), что позволяет предположить, что эти три RBP могут полагаться на аналогичный механизм трансляционной регуляции, который зависит от структур 5′-UTR общих мишеней. Интересно, что мы обнаружили, что положительно и отрицательно коррелирующие мишени были вовлечены в различные функции и клеточные компартменты ( S4C, рис. ). Например, положительно коррелирующие мишени из DDX3X и EFTUD2 были обогащены белками, которые составляют рибонуклеопротеиновые комплексы, в соответствии с недавним исследованием, которое показало сильное снижение трансляции рибонуклеопротеинов после нокдауна DDX3X [53].Напротив, отрицательно коррелирующие мишени DDX3X и EFTUD2 были обогащены белками, локализованными в мембраносвязанных цитоплазматических органеллах, таких как митохондрии.

Рис. 4. Дифференциальное сродство многофункциональных RBP к структурам 5’UTR часто приводит к противоположным количественным эффектам TE.

(A) Точечный график, показывающий значимость различий в минимальной свободной энергии 5’ UTR (MFE, нормализованная по длине) между генами-мишенями, которые положительно или отрицательно коррелируют с каждым многофункциональным RBP.Значения значимости рассчитываются отдельно для целей мРНК (зеленый) и TE (коричневый). Скорректированные значения p показаны по шкале -log10 и рассчитаны с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона, и оценивались только последовательности 5’UTR с минимальной длиной 20 нуклеотидов. Пунктирная вертикальная линия указывает минимальное скорректированное значение p, чтобы считать различия в MFE значимыми (p adj <0,05). B .Для сравнения на панельный рисунок были включены некоррелирующие гены-мишени. (C) Трехсторонняя диаграмма Венна, представляющая перекрытие количества целей TE для трех выбранных RBP. Тепловая карта представляет корреляции TE 156 общих генов-мишеней для трех случаев.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.g004

Обсуждение

Все больше данных свидетельствует о том, что RBP могут действовать как многофункциональные регуляторы экспрессии генов [14,54].Здесь мы создали метод in-silico для крупномасштабного анализа регуляции, управляемой RBP, с использованием корреляции в качестве показателя количества мРНК и эффективности трансляции (TE) генов-мишеней в 80 образцах сердца человека. Наш подход подчеркивает функциональную важность флуктуаций экспрессии RBP в контроле экспрессии генов, механистическую особенность, недавно отмеченную другими in vitro и in vivo , чтобы назначить новые неизвестные роли для RBPs [30-32]. Мы использовали количественный эффект RBP на известные гены-мишени, чтобы задействовать 74 RBP в регуляции численности или трансляции мРНК.

Мы обнаружили 27 RBP с ранее неизвестной ролью в трансляции, некоторые из которых имеют хорошо охарактеризованные функции в других биологических процессах, включая сплайсинг мРНК. Предыдущая работа выявила несколько факторов сплайсинга, которые могут независимо обеспечивать активность после сплайсинга, такую ​​как трансляция мРНК [55-57]. Вместо этого альтернативный сплайсинг, опосредованный факторами сплайсинга, может вызывать последующие эффекты на трансляцию генов-мишеней сплайсинга, в зависимости от качественного решения, какие изоформы мРНК продуцируются [19-29].Примечательно, что высокая доля факторов сплайсинга, которые, как мы обнаружили, влияют на трансляцию, предполагает ранее непредвиденную роль многих других регуляторов сплайсинга в этом процессе. Ярким примером является специфичный для мышц и связанный с сердечными заболеваниями регулятор сплайсинга RBM20. RBM20 является репрессором сплайсинга, который модулирует распространенность изоформ многих генов саркомеров [33,58]. Здесь мы демонстрируем, что экспрессия RBM20 положительно коррелирует с TE TTN и др. генов саркомеров, предполагая, что контроль ядерного сплайсинга может влиять на синтез цитоплазматического белка.Хотя ранее мы сообщали, что существуют изменения в TE, специфичные для изоформы TTN [34], теперь мы впервые показываем, что RBM20 оказывает решающее влияние на трансляционный выход TTN . Будущие функциональные исследования должны определить специфический способ действия факторов сплайсинга, участвующих в трансляции, и способствуют ли какие-либо специфичные для изоформ характеристики наблюдаемым различиям в TE.

Помимо открытия потенциальных новых функций для подмножества RBP, мы предоставляем доказательства того, что 21 RBP может модулировать как содержание мРНК-мишени, так и TE — класс RBP, который мы классифицируем как «многофункциональные RBP».Многофункциональные RBP, по-видимому, участвуют в регуляции количества мРНК и TE различных групп генов-мишеней. Эти гены-мишени могут согласовываться или дискордантно регулироваться на любом уровне контроля экспрессии генов. Мы обнаружили, что специфическое сродство нескольких RBP к структурным свойствам мРНК, таким как длина последовательности, кодирующей белок, длина UTR или вторичная структура РНК, вносят отдельный вклад в наблюдаемые независимые эффекты на количество или трансляцию мРНК. Следовательно, требуется дальнейшая экспериментальная проверка, чтобы подтвердить количественный эффект каждого отдельного многофункционального RBP и определить точные механизмы, лежащие в основе этой двойной функциональности.В поддержку наших выводов недавнее исследование [32] изучало связь между кинетикой связывания RBP DAZL и его влиянием на количество мРНК и трансляцию определенных наборов генов-мишеней, определяя некоторые особенности 3′-UTR — длину UTR, присутствие кластеров связывания, расстояние до сайта полиаденилирования, которые связаны с специфической регуляцией различных групп мишеней. Кроме того, использование разных доменов связывания рибосом, распознавание альтернативных мотивов RBP и наличие сайтов связывания, расположенных в разных областях генов (т.э., UTR, CDS или интроны) также могут свидетельствовать о полифункциональности RBP [59]. Тем не менее, мы обнаружили, что эти характеристики мРНК остаются в значительной степени неизменными для мишеней большинства многофункциональных RBP, идентифицированных в этом исследовании.

Для подгруппы многофункциональных RBP мы заметили, что мишени, регулируемые на транскрипционном или трансляционном уровне, представляют функционально разные классы генов. Действительно, наблюдаемое в нашем исследовании биологическое разнообразие, по-видимому, соответствует сложности регуляции, специфичной для конкретного состояния, которая должна быть достигнута с помощью одного RBP.Например, это, по-видимому, относится к G3BP1 — известному многофункциональному RBP, который может избирательно компартментализировать определенные наборы мРНК в стрессовые гранулы, чтобы перепрограммировать трансляцию мРНК в определенных глобальных стрессовых условиях [60–62], а также в тканях. специфические контексты, такие как мерцательная аритмия в сердце [63]. Кроме того, G3BP1 играет важную роль в раскручивании ДНК/РНК [64] и связывается со специфическими структурами стебель-петля РНК, запуская деградацию мРНК [65], что необходимо для клиренса материнской мРНК [66].Другим примером является DDX3X, бокс-хеликаза DEAD, которая может реагировать на стрессоры (например, вирусные инфекции [67]) путем переключения субклеточных компартментов. DDX3X участвует во многих процессах, необходимых для метаболизма РНК [42, 43], для чего он использует свою способность раскручивать сложные и структурированные 5′-UTR, чтобы способствовать инициации трансляции в выбранных подмножествах мРНК [43, 49, 52, 68]. Тем не менее, продолжаются споры о точной роли DDX3X и механизмах, посредством которых он регулирует метаболизм РНК [68], поскольку он может действовать как репрессор или активатор трансляции [69].

Наша работа указывает на сложную связь между направлением регуляции трансляции и целевой структурой 5′-UTR, при этом на TE определенных мишеней положительно или отрицательно влияет многофункциональное связывание RBP в зависимости от сложности целевых последовательностей 5′-UTR. Неожиданно наши результаты показывают, что повышенные уровни DDX3X коррелируют с более низким TE для целей с высокоструктурированными 5′-UTR. Это, по-видимому, противоречит недавним сообщениям in vitro , в которых нокдаун DDX3X в клетках человека [52] приводил к репрессии трансляции мРНК со структурированными 5′-UTR.Наряду с DDX3X, наиболее сильное влияние 5′-UTR на трансляционный выход наблюдается для EFTUD2 и PRPF8, которые демонстрируют паттерны регуляции, очень похожие на DDX3X, что предполагает аналогичный способ действия в контроле целевых скоростей трансляции. Удивительно, но EFTUD2 и PRPF8 являются факторами сплайсинга, которые являются частью центрального компонента сплайсосомы U5 snRNP [70] и ранее не участвовали в трансляции. Однако консервативная GTPase EFTUD2 имеет сходство последовательности с фактором элонгации трансляции EF-2 [71], что, возможно, объясняет ее способность влиять на трансляцию.Оба древних паралога могли развиваться и диверсифицироваться, чтобы дополнять друг друга.

В то время как двойная функциональность широко изученных и охарактеризованных RBP, таких как DDX3X и G3BP1, была (в определенной степени) описана ранее, для ряда других RBP наши результаты обеспечивают первоначальные наблюдения двойной функциональности. Например, UCHL5 (также известная как UCh47) представляет собой протеазу со способностью связывания РНК, которая может быть частью комплекса ремоделирования хроматина INO80 [72], хотя ее роль в метаболизме РНК пока неизвестна.Мы установили количественную связь между экспрессией UCHL5 и вариабельностью содержания мРНК генов, участвующих в организации хроматина, а также с изменением ТЕ генов, участвующих в сплайсинге РНК. Хотя UCHL5 имеет общие гены-мишени с коровыми факторами сплайсинга (U2AF2, EFTUD2 и PRPF8), его влияние на TE мишеней, общих с этими тремя факторами сплайсинга, полностью противоположно, что предполагает контрастное регуляторное поведение и, возможно, конкуренцию.

Очень мало известно о молекулярных процессах, которые контролируют многофункциональность RBP, хотя недавно были исследованы некоторые возможные механизмы, включая образование гетерогенных комплексов RBP [73,74], переключение мономеров на мультимеры в зависимости от концентрации [75]. и изменения субклеточной локализации [55,76].В нашем текущем исследовании потенциальные механизмы, лежащие в основе наблюдаемой многофункциональности, не могут быть объяснены единообразно: похоже, не существует универсального сценария для всех. Весьма вероятно, что многофункциональность RBP достигается за счет специфических комбинаций индивидуальных RBP и целевых признаков, точное выделение которых требует экспериментального исследования каждой отдельной многофункциональной RBP. RBP может связывать различные наборы РНК в ядре, хотя для подмножества целей последствия связывания могут стать очевидными только на более поздней стадии экспрессии генов (т.g., изменение продукции изоформ транскрипта, которое сопровождается последующим эффектом на TE). Альтернативно, многофункциональные RBP могут физически принимать участие во многих стадиях экспрессии генов, адаптируясь к субклеточным локализациям. Например, HNRNPM (один из основных сплайсинговых рибонуклеопротеинов, который, как мы обнаружили, влияет как на изобилие мРНК целевого гена, так и на TE) локализуется в ядре [16], но может экспортироваться в цитозоль, чтобы индуцировать кэп-независимую трансляцию при гипоксии [55]. Другой пример, DDX3X, перемещается между ядром и цитозолем [67].Остается установить, связываются ли RBP с общими мишенями с этими мишенями одновременно, или существуют последовательные перекрестные помехи RBP и др. белков в контроле экспрессии мишеней. Изобилие RBP может также реагировать на доступность мишени, а не наоборот , что, возможно, объясняет, почему мы находим, что многие регуляторы сплайсинга занимают высокое место в иерархии RBP.

Существуют ограничения на методы, которые мы используем для определения биологических ролей RBP и назначения каждой цели.Во-первых, мы отмечаем, что значимые ассоциации также возникают в случайно выбранных целевых наборах, что указывает на определенный уровень нечеткости в назначении RBP-цели. Это кажется неизбежным для RBP с общими функциями контроля экспрессии, которые связывают и совместно используют большое количество мишеней. Однако вместе с рассчитанной дельтой Гласса распределения значимых корреляций в 100 000 случайно выбранных целевых наборов дают нам хорошее представление о нашей частоте ложных открытий при назначении целей.В частности, для исследований эффектов связывания RBP с отдельными генами-мишенями наличие потенциальных ложноположительных значимых корреляций указывает на необходимость независимой экспериментальной проверки. Второе ограничение включает использование экспериментов eCLIP с двумя клеточными линиями, не связанными с сердцем. Наши результаты выиграют от крупномасштабных экспериментов CLIP, специфичных для сердца человека, которые лучше дополняют тканеспецифичность сердечных экспрессируемых генов. Тем не менее, все обнаруженные многофункциональные RBP повсеместно экспрессируются в тканях человека ( S1A Fig ), что указывает на то, что эти белки играют важную роль в регуляции транскрипции и трансляции РНК, способствуя как глобальным, так и клеточным или тканеспецифическим проявлениям.

В заключение, наши результаты иллюстрируют непредвиденную сложность взаимодействия RBP-РНК на нескольких последовательных уровнях экспрессии генов. Это требует будущих углубленных экспериментальных исследований идентифицированных RBP в биологии сердца человека. Понимание того, как RBP взаимодействуют, общаются, взаимодействуют и конкурируют между субклеточными компартментами и в ответ на изменяющиеся условия, необходимо для полного понимания количественной природы регуляторных принципов, лежащих в основе метаболизма мРНК.

Методы

Анализ данных профилирования рибосом и секвенирования РНК

Мы повторно проанализировали профилирование рибосом (Ribo-seq) и сопоставили наборы данных RNA-seq из 80 человеческих сердец, которые мы создали и опубликовали ранее (код доступа EGA: EGAS00001003263) [34]. Короче говоря, чтения Ribo-seq были вырезаны для остаточных адаптеров с использованием инструментария FASTX [77]. Прочтения, сопоставленные с последовательностями митохондриальной РНК, рибосомной РНК и тРНК, были удалены из последующего анализа. Полноразмерные парные считывания мРНК-seq (2 × 101 нт) были урезаны до 29-меров (средняя длина считываний Ribo-seq), чтобы провести сопоставимый анализ наборов данных Ribo-seq и mRNA-seq и избежать какой-либо систематической ошибки при картировании или количественной оценке из-за для различной длины чтения или фильтрации.Затем Ribo-seq и усеченные чтения mRNA-seq были сопоставлены с эталонным геномом человека (GRCh48, Ensembl v87) с использованием STAR v2.5.2b [78] с максимум 2 несовпадениями и -seedSearchStartLmaxOverLread = 0,5. Количественную оценку экспрессии генов проводили путем подсчета прочтений, картирующих области кодирующей последовательности (CDS) аннотированных генов, кодирующих белок, с использованием HTSeq v0.9.1 [79]. Количество генов было нормализовано путем одновременной оценки факторов размера в наборах данных Ribo-seq и RNA-seq с использованием DESeq2 v1.12.4 [80].Эта совместная нормализация необходима для сравнения обеих мер экспрессии генов [81]. Трансляционная эффективность (TE) рассчитывалась по соотношению Ribo-seq против RNA-seq для каждого отдельного гена и образца, как описано ранее [34].

Идентификация целей RBP из опубликованных данных eCLIP и HITS-CLIP

Обработанные данные eCLIP для 150 RBP были получены от ENCODE (30) для клеточных линий HepG2 (n = 103) и K562 (n = 120). Наборы данных состояли из файлов BED, содержащих пики eCLIP, и файлов BAM, содержащих чтения, сопоставленные с геномом человека (GRCh48.p10/hg38). Идентификацию устойчивых пиков eCLIP в репликах и клеточных линиях проводили, как это было предложено Ван Нострандом и его коллегами [12]. Во-первых, мы использовали BEDTools [82] для количественной оценки охвата каждого предсказанного пика с использованием входных (фиктивных) файлов BAM и файлов иммунопреципитации (IP, антитело против RBP). Затем для каждого пика относительную информативность определяли как p i x log2 (p i/ q i ), где p и q представляют собой сумму прочтений, сопоставленных с пиком в IP и отрицательном контроле соответственно. .Информационное содержание использовалось для расчета коэффициента невоспроизводимого обнаружения (IDR) [83], параметра, указывающего на воспроизводимые пики в биологических повторах. Был определен значимый и воспроизводимый пик, отвечающий порогу IDR < 0,01, значению p ≤ 10 -5 и кратному обогащению (FC) > 8. В случае, если два или более пика перекрывают один и тот же участок генома, наиболее значимый один был включен в таблицу пиков. Кроме того, неперекрывающиеся пики объединяли в одну таблицу, чтобы получить полный набор в обеих клеточных линиях.В то время как данные CLIP были получены в несердечных условиях, сигналы CLIP обычно сохраняются среди одинаково экспрессируемых генов одного и того же RBP, независимо от клеточной линии, с пиковыми различиями, вместо этого отражающими специфичную для типа клеток экспрессию, а не аффинность связывания [12]. Кроме того, для мышечно-специфического репрессора сплайсинга RBM20, который не был частью набора данных ENCODE, но включен из-за его важности для сердечного сплайсинга и сердечных заболеваний [33,58], важные мишени RBM20 HITS-CLIP для крыс были получены от Maatz et al.[33] и преобразованы в геномные координаты GRCh48.p10/hg38. Было сохранено только 143 RBP с экспрессией в ткани сердца человека (среднее значение FPKM по образцам> 1; 142 RBP ENCODE и RBM20).

В целом мы получили в среднем 4300 пиков eCLIP-seq за эксперимент. Наконец, мы сопоставили эти пики с аннотированным транскриптомом (Ensembl v.87), и для каждого эксперимента RBP все гены, поддерживаемые по крайней мере одним пиком CLIP-seq, были определены как предполагаемые гены-мишени.

Корреляция и кластеризация RBP-цели

Для корреляции RBP-мишень и кластеризации мы включили гены, экспрессированные в сердце человека (среднее значение FPKM по образцам> 1), по крайней мере, с одной последовательностью Ribo-seq и mRNA-seq, прочитанной как минимум в 20 образцах (n = 11 387).Затем для парных полных наблюдений мы рассчитали корреляции Спирмена между уровнем экспрессии RBP (измеряемым с помощью Ribo-seq) и количеством мРНК-seq целевого гена или эффективностью трансляции. Только гены-мишени, показавшие значительную (p adj ≤ 0,05) корреляцию после поправки на множественное тестирование с использованием подхода Бенджамини-Хохберга [84], были сохранены для последующих анализов. Вычисленная матрица корреляции RBP-цель использовалась для расчета евклидова расстояния с последующей иерархической кластеризацией, чтобы сгруппировать RBP с аналогичными последствиями для их генов-мишеней.Визуализация кластера была сделана с использованием тепловой карты.3 (https://github.com/obigriffith/biostar-tutorials/tree/master/Heatmaps). Чтобы обеспечить достоверную корреляцию между RBP и его генами-мишенями и исключить количественную связь (коллинеарность) между двумя RBP, мы выбрали кластеры RBP и генов-мишеней со схожими профилями экспрессии и рассчитали частичные корреляции. Статистическое сравнение было выполнено с помощью Z-преобразования Фишера двух коэффициентов корреляции к нормальному распределению.

Обогащение целевого гена

Чтобы идентифицировать RBP, которые являются предполагаемыми модуляторами содержания мРНК целевого гена и/или TE, мы рассчитали частоту, с которой гены-мишени, подтвержденные данными CLIP-seq, значительно коррелировали с каждым RBP.Мы усилили значение этих коррелирующих ассоциаций, создав 100 000 наборов теоретических мишеней одинакового размера из всех транслируемых генов в человеческом сердце; подход, который ранее показал свою высокую эффективность [30]. Для каждого набора мы количественно определили количество значительно коррелирующих генов и сравнили теоретическое распределение с фактическим наблюдением, применяя эмпирический тест: Эмпирическое значение p = сумма (теоретические цели ≥ истинные цели RBP) /100 , 000 .

Эмпирические значения p были скорректированы для множественного тестирования (метод Бенджамини-Хохберга). RBP, которые показали значительное (p adj ≤ 0,05) обогащение коррелирующих генов-мишеней, полученных из CLIP, рассматривались как предполагаемые регуляторы содержания мРНК (n = 58) и/или TE (n = 37). Следует отметить, что из-за фиксированного количества сгенерированных случайных наборов минимальное эмпирическое значение p, которое может быть рассчитано после поправки на множественное тестирование, составляет 5,25 x 10 -5 . Следовательно, эмпирический тест не может количественно определить силу значимости конкретного наблюдения.Вместо этого мы рассчитали дельту Гласса (△) [36] как меру размера эффекта, который определяется как разница между двумя целевыми наборами, деленная на стандартное отклонение теоретической группы. Величина эффекта = (истинные целевые значения RBP — среднее (теоретические целевые значения)) / sd (теоретические целевые значения)

Экспрессия RBP в тканях GTEx

Чтобы определить паттерны экспрессии каждого RBP в тканях человека, мы получили данные экспрессии из проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) [85], базы данных, которая включает большой набор образцов, соответствующих 54 тканям человека.Мы использовали эти данные для определения количества тканей с обнаруживаемой (средний TPM ≥ 1) или высокой (средний TPM ≥ 10) экспрессией данного RBP ( S1A Fig ). RBP считался повсеместно экспрессирующимся, если экспрессия была обнаружена более чем в 30 тканях с TPM ≥ 10.

Репликация целевой регуляции с использованием общедоступной когорты фибробластов

Мы получили необработанные данные секвенирования РНК и рибо-секвенирования из когорты из 20 первичных культур сердечных фибробластов, стимулированных TGF-бета [30], и использовали их в качестве когорты репликации.Необработанные данные доступны через репозиторий омнибуса экспрессии генов (представление GEO: GSE131112, GSE123018, GSE131111). Предварительная обработка считывания, картирование, количественная оценка генов и корреляционный анализ выполнялись в соответствии с теми же процедурами, которые описаны выше для наборов данных сердца (см. подразделы «Картирование считывания и количественная оценка генов» и «Корреляция и кластеризация RBP-цель»). Чтобы доказать, что регуляторный эффект RBP в регуляции трансляции-мишени может быть воспроизведен в независимом наборе данных, мы количественно определили долю корреляций RBP-мишень с аналогичным направлением регуляции как в когортах фибробластов, так и в когортах сердца человека.Статистическую значимость наблюдаемых повторений оценивали путем запуска 10 000 перестановок коэффициентов корреляции в фибробластах и ​​сравнения доли общей направленности между обеими когортами в наблюдаемых и рандомизированных выборках.

Анализ дифференциального сплайсинга экзонов

Чтобы оценить, может ли RBM20 влиять на TE генов-мишеней путем модулирования коэффициентов производства изоформ (включение или исключение экзона), мы оценили скорость сплайсинга экзонов, вычислив процент сплайсинга (PSI) для всех экзонов известных и коррелирующих генов-мишеней RBM20, как описано ранее [86].Для расчета PSI мы повторно сопоставили наборы данных 80 парных концов сердечной мРНК-seq (2 × 101 нт), чтобы улучшить охват сайтов сплайсинга с использованием STAR v2.5.2b [78], допуская максимум 6 несоответствий.

Функциональный анализ ассоциаций RBP и генов-мишеней

Известные и прогнозируемые взаимодействия RBP-RBP были извлечены из базы данных STRING [40] с достоверными границами сети и настройками по умолчанию. Кроме того, мы присвоили биологические функции для определения генных мишеней с помощью gProfiler2 v0.1.9 (архивная версия fof4439, [87]) и извлекли обогащенные наборы «дочерних» и «родительских» терминов GO для отдельных наборов мРНК и TE-мишеней (p adj ≤ 0.05). Были рассмотрены значимые термины GO, которые включают минимум 20 и максимум 500 генов, чтобы избежать включения слишком общих терминов, которые показывают значимость из-за полезного соотношения входных данных и размера термина.

Анализ минимальной свободной энергии в 5’ UTR

Мы предсказали вторичные структуры 5′-UTR посредством минимизации энергии, используя RNAfold из пакета Vienna Package v2.4 [88]. Используя последовательность 5′-UTR каждого гена-мишени в качестве входных данных, были рассчитаны минимальные свободные энергии (MFE) и нормализованы по длине, чтобы наблюдать различия в сложности UTR для генов-мишеней, которые положительно или отрицательно коррелируют с RBP.

Общие замечания по статистическому анализу

Статистический анализ и генерация рисунков были выполнены с использованием R v3.6.2 [89]. Полный список инструментов и методов, используемых для анализа данных, указан в каждом соответствующем разделе «Методы». Статистические параметры, такие как n , медиана/среднее, стандартное отклонение (SD) и значимость, указаны на рисунках и/или в подписях к рисункам. « n » представляет количество RBP в рис. 4, S3, A и S4.

Вспомогательная информация

S1 Таблица. Аналитическая информация для 143 RBP.

Таблица со всеми 143 сердечными экспрессируемыми RBP, числом мРНК и TE, коррелирующими мишенями, и значимостью корреляций, кластерами корегулируемых RBP и средними уровнями экспрессии РНК в левом желудочке человека.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.s001

(XLSX)

Данные S1. Объект RData, содержащий матрицы подсчета поли(А) РНК-секвенций и рибо-секвенций, нормализованные по стандарту DESeq2, вместе, матрицу ТЕ (рибо-секвенция/РНК-секвенция) и матрицу подсчета PSI.

Чтобы получить доступ к этому файлу, скачайте R и загрузите объект RData с помощью функции R load: load(RData).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.s004

(ZIP)

Данные S2. Объект RData, содержащий корреляционные матрицы, глобальные таблицы результатов и размера эффекта для всех мРНК-RBP и TE-RBP, а также таблицу со значениями MFE для всех целевых транскриптов для каждого TE-RBP.

Чтобы получить доступ к этому файлу, загрузите R и загрузите объект RData с помощью функции R load : load(RData).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.s005

(ZIP)

S1 Рис. Содержание РНК-связывающего белка предсказывает целевую регуляцию трансляции.

(A) Гистограмма, показывающая закономерности экспрессии 143 RBP в тканях. Средние значения экспрессии в единицах транскрипта на миллион (TPM) были получены из проекта экспрессии генотипа и ткани (GTEx). Большинство RBP повсеместно экспрессируются в тканях человека. (B) Сети белок-белковых ассоциаций STRING из шести совместно регулируемых кластеров RBP (см. также , рис. 1A ).Большинство сгруппированных RBP участвуют в известных функциональных взаимодействиях. (C) Тепловые карты со стеклом △ баллов для всех 37 TE-RBP, определяющих размер эффекта свидетелей для значительных корреляций TE.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.s006

(TIF)

S2 Рис. Анализ CLIP идентифицирует коререгулируемые

in vivo мишени новых мастер-регуляторов трансляции в сердце человека.

(A) Функции, описанные Van Nostrand et al.для набора TE-RBP. Функции, связанные с трансляцией (регуляция трансляции и основная трансляция рибосом), выделены темно-красными прямоугольниками. (B-C) Диаграммы рассеяния, представляющие корреляцию эффективности трансляции сердца (B) и первичных сердечных фибробластов (C) между UCHL5 и U2AF2 и двумя общими мишенями, KPNA4 и MYL6 . UCHL5 и U2AF2 оказывают противоположное влияние на свои общие мишени, что свидетельствует о конкурентном эффекте, воспроизведенном в двух независимых наборах данных.Отображаются баллы и уровень значимости двух корреляций Спирмена.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.s007

(TIF)

S3 Рис. Многофункциональные RBP регулируют трансляцию различных наборов генов-мишеней.

(A) Сеть, представляющая многофункциональные взаимодействия RBP-мишень как для мРНК-RBP (зеленый), так и для TE-RBP (коричневый) сильно коррелирующих пар. Синие линии указывают на общие мишени как в количестве мРНК, так и в регуляции TE одного и того же RBP. (B) Слева: тепловая карта, представляющая средние значения корреляции мРНК и TE RBP-цель для всех 21 многофункциональных RBP. В центре: тепловая карта, представляющая различия в относительной доле сайтов связывания признаков (TE-мРНК) для всех 21 многофункциональных RBP. Справа: гистограмма, показывающая общую долю сайтов связывания признаков для всех 21 многофункциональных RBP. (C) Блочные диаграммы с длинами последовательностей 5′-UTR, CDS и 3′-UTR в нуклеотидах для мишеней мРНК и TE, соответствующих набору из 21 многофункциональной RBP.Для каждого целевого гена представлена ​​наиболее распространенная изоформа.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.s008

(TIF)

S4 Рис. Дифференциальное сродство многофункциональных RBP к структурам 5’UTR часто приводит к противоположным количественным эффектам TE.

(A) Графики в виде прямоугольника и скрипки с длиной 5’ UTR для положительно и отрицательно коррелированных целей TE, соответствующих DDX3X, EFTUD2 и PRPF8. (B) Диаграммы в виде прямоугольника и скрипки с нормализованными по длине показателями MFE для положительно и отрицательно коррелированных целей TE.Мы отобрали наборы из 50 генов на группу и RBP, поэтому каждая из групп имела одинаковое распределение длин 5’UTR. Для сравнения на панельный рисунок были включены некоррелирующие гены-мишени. (C) Обогащенные термины GO в наборах положительных и отрицательных коррелирующих целей для DDX3X, EFTUD2 и PRPF8. Для каждого RBP отображаются 5 наиболее значимых терминов GO.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009658.s009

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить проф.Доктору Маркусу Ландталеру за его полезные отзывы и обсуждения.

Каталожные номера

  1. 1. Герстбергер С., Хафнер М., Тушл Т. Перепись человеческих РНК-связывающих белков. Нат Рев Жене. 2014; 15: 829–845. пмид:25365966
  2. 2. Caudron-Herger M, Rusin SF, Adamo ME, Seiler J, Schmid VK, Barreau E, et al. R-DeeP: полнопротеомная и количественная идентификация РНК-зависимых белков с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Мол Ячейка. 2019;75: 184—199.е10. пмид:31076284
  3. 3. Маллам А.Л., Сае-Ли В., Шауб Дж.М., Ту Ф., Баттенхаус А., Джанг Ю.Дж. и др. Систематическое открытие эндогенных рибонуклеопротеиновых комплексов человека. Cell Rep. 2019;29: 1351—1368.e5. пмид:31665645
  4. 4. Trendel J, Schwarzl T, Horos R, Prakash A, Bateman A, Hentze MW, et al. РНК-связывающий протеом человека и его динамика во время остановки трансляции. Клетка. 2019;176: 391—403.e19. пмид:30528433
  5. 5. Кастелло А., Фишер Б., Фрезе К.К., Хорос Р., Аллом А.М., Фёр С. и др.Комплексная идентификация РНК-связывающих доменов в клетках человека. Мол Ячейка. 2016; 63: 696–710. пмид:27453046
  6. 6. Бекманн Б.М., Кастелло А., Меденбах Дж. Расширяющаяся вселенная рибонуклеопротеинов: новые РНК-связывающие белки и нетрадиционные взаимодействия. Арка Пфлюгера. 2016; 468: 1029–1040. пмид:27165283
  7. 7. Kong X, Chen YY, Lin J, Flowers E, Van Nostrand E, Blue SM и др. Загрузчик когезина NIPBL взаимодействует с пре-рибосомной РНК и патокой, чтобы регулировать синтез рибосомной РНК.bioRxiv. 2019;
  8. 8. Дасси Э. Рукопожатия и драки: регуляторное взаимодействие РНК-связывающих белков. Фронт Мол Биоски. 2017;4: 67. pmid:2

    45
  9. 9. Диас-Муньос, доктор медицины, Тернер М. Раскрытие роли РНК-связывающих белков в экспрессии генов в иммунной системе. Фронт Иммунол. 2018;9: 1094. pmid:29875770
  10. 10. Грей Н.К., Грабалкова Л., Скэнлон Д.П., Смит Р.В.П. Поли(А)-связывающие белки и локализация мРНК: кто правит насестом? Биохим Сок Транс.2015; 43: 1277–1284. пмид:26614673
  11. 11. Югами М., Окано Х., Наканиши А., Яно М. Анализ ядерно-цитоплазматического челночного РНК-связывающего белка HNRNPU с использованием оптимизированного метода HITS-CLIP. ПЛОС Один. 2020;15: e0231450. пмид:32302342
  12. 12. Ван Ностранд Э.Л., Фриз П., Пратт Г.А., Ван Х., Вэй Х., Сяо Р. и др. Крупномасштабная карта связывания и функциональная карта РНК-связывающих белков человека. Природа. Спрингер США; 2020; 583: 711–719. пмид:32728246
  13. 13. Гилбертсон С., Федершпиль Дж. Д., Хартениан Э., Кристи И. М., Глаунсингер Б.Изменения в количестве мРНК вызывают перемещение РНК-связывающих белков, связывая деградацию цитоплазматической РНК с транскрипцией. Элиф. 2018;7. пмид:30281021
  14. 14. Backlund M, Stein F, Rettel M, Schwarzl T, Perez-Perri JI, Brosig A, et al. Пластичность ядерных и цитоплазматических стрессовых реакций РНК-связывающих белков. Нуклеиновые Кислоты Res. 2020; 48: 4725–4740. пмид:32313943
  15. 15. Хиннебуш АГ. Сканирующий механизм эукариотической инициации трансляции. Анну Рев Биохим.2014; 83: 779–812. пмид:24499181
  16. 16. Harvey SE, Xu Y, Lin X, Gao XD, Qiu Y, Ahn J и др. Корегуляция альтернативного сплайсинга с помощью hnRNPM и ESRP1 во время ЕМТ. РНК. 2018; 24: 1326–1338. пмид:30042172
  17. 17. Ши З., Фуджи К., Ковари К.М., Генут Н.Р., Рёст Х.Л., Теруэль М.Н. и др. Гетерогенные рибосомы преимущественно транслируют отдельные субпулы мРНК по всему геному. Мол Ячейка. 2017;67: 71—83.e7. пмид:28625553
  18. 18. Simsek D, Tiu GC, Flynn RA, Byeon GW, Leppek K, Xu AF, et al.Рибоинтерактом млекопитающих обнаруживает функциональное разнообразие и гетерогенность рибосом. Клетка. 2017;169: 1051—1065.e18. пмид:28575669
  19. 19. Лим К.С., Т. Уорделл С.Дж., Клеффманн Т., Браун К.М. Экзон-интронная структура гена выше кодона инициации предсказывает эффективность трансляции. Нуклеиновые Кислоты Res. 2018; 46: 4575–4591. пмид:29684192
  20. 20. Wang SE, Brooks AES, Poole AM, Simoes-Barbosa A. Детерминанты эффективности трансляции у эволюционно расходящихся простейших Trichomonas vaginalis.BMC Mol Cell Biol. 2020;21:54. pmid:32689943
  21. 21. Леппек К., Дас Р., Барна М. Функциональные структуры мРНК 5’UTR в регуляции трансляции у эукариот и как их найти. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018; 19: 158–174. пмид:29165424
  22. 22. Пеллетье Дж., Соненберг Н. Вставочный мутагенез для увеличения вторичной структуры в 5′-некодирующей области эукариотической мРНК снижает эффективность трансляции. Клетка. 1985; 40: 515–526. пмид:2982496
  23. 23.Могер Д.М., Кабрал Б.Дж., Пресняк В., Су С.В., Рейд Д.В., Гудман Б. и др. Структура мРНК регулирует экспрессию белка за счет изменения функционального периода полужизни. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019; 116: 24075–24083. пмид:31712433
  24. 24. Ченг С., Фахми Н.А., Пак М., Чанг Дж.В., Сун Дж., Тао К. и др. Обусловленный mTOR широко распространенный пропуск экзонов приводит к многогранной регуляции генов и сложности протеома. bioRxiv. Лаборатория Колд-Спринг-Харбор; 2020; 2020.02.27.967737.
  25. 25.Катахира Дж. Ядерный экспорт матричной РНК. Гены (Базель). 2015;6: 163–184. пмид:25836925
  26. 26. Драммонд Д.А., Уилке К.О. Неправильный фолдинг белка, вызванный неправильным переводом, как доминирующее ограничение эволюции кодирующей последовательности. Клетка. 2008; 134. пмид:18662548
  27. 27. Qian W, Yang J-R, Pearson NM, Maclean C, Zhang J. Сбалансированное использование кодонов оптимизирует эффективность трансляции эукариот. Генетика PLoS. 2012;8: e1002603. пмид:22479199
  28. 28. Нотт А., Ле Хир Х., Мур М.Дж.Сплайсинг усиливает трансляцию в клетках млекопитающих: дополнительная функция комплекса соединения экзонов. Гены Дев. Соединенные Штаты; 2004; 18: 210–222. пмид:14752011
  29. 29. Льюис Б.П., Грин Р.Е., Бреннер С.Е. Доказательства широко распространенного сочетания альтернативного сплайсинга и нонсенс-опосредованного распада мРНК у людей. Proc Natl Acad Sci U S A. Национальная академия наук; 2003; 100: 189–192. пмид:12502788
  30. 30. Chothani S, Schäfer S, Adami E, Viswanathan S, Widjaja AA, Langley SR, et al.Широко распространенный трансляционный контроль фиброза в сердце человека с помощью РНК-связывающих белков. Тираж. 2019; пмид:31284728
  31. 31. Luo EC, Nathanson JL, Tan FE, Schwartz JL, Schmok JC, Shankar A, et al. Крупномасштабные анализы связанных функций идентифицируют факторы, которые регулируют стабильность и трансляцию мРНК. Nat Struct Mol Biol. 2020; 27: 989–1000. пмид:32807991
  32. 32. Шарма Д., Загоре Л.Л., Бристер М.М., Йе Х., Креспо-Эрнандес К.Е., Ликаталоси Д.Д. и др. Кинетический ландшафт РНК-связывающего белка в клетках.Природа. Издательская группа «Природа»; 2021; 1–5. пмид:33568810
  33. 33. Маатц Х., Йенс М., Лисс М., Шафер С., Хайниг М., Киршнер М. и др. РНК-связывающий белок RBM20 репрессирует сплайсинг, чтобы организовать процессинг сердечной пре-мРНК. Джей Клин Инвест. 2014; 124: 3419–3430. пмид:24960161
  34. 34. ван Хиш С., Витте Ф., Шнайдер-Луниц В., Шульц Дж. Ф., Адами Э., Фабер А. Б. и др. Трансляционный ландшафт человеческого сердца. Клетка. США, США; 2019; 178: 242–260.е29. пмид:31155234
  35. 35. Шафер С., Адами Э., Хайниг М., Родригес К.Е.К., Кройхвиг Ф., Силхави Дж. и др. Трансляционная регуляция формирует молекулярный ландшафт сложных фенотипов заболеваний. Нац коммун. 2015;6: 7200. pmid:26007203
  36. 36. Фриман П.Р., Хеджес Л.В., Олкин И. Статистические методы метаанализа. Биометрия. 1986; 42: 454.
  37. 37. Сазерленд Л.С., Ван К., Робинсон А.Г. RBM5 как предполагаемый ген-супрессор рака легких [Интернет].Журнал торакальной онкологии. Липпинкотт Уильямс и Уилкинс; 2010. С. 294–298. пмид:20186023
  38. 38. Либерман Н., Мараш Л., Кимчи А. Фактор инициации трансляции DAP5 является регулятором выживания клеток во время митоза. Клеточный цикл. 2009;8: 204–209. пмид:19158497
  39. 39. Вебер Р., Климанн Л., Хиршберг И., Чанг М., Валков Э. IC. DAP5 обеспечивает повторную инициацию трансляции на структурированных матричных РНК. bioRxiv. 2021;
  40. 40. Шклярчик Д., Гейбл А.Л., Лион Д., Юнге А., Видер С., Уэрта-Сепас Дж. и др.STRING v11: сети белок-белковых ассоциаций с увеличенным охватом, поддерживающие функциональные открытия в полногеномных экспериментальных наборах данных. Нуклеиновые Кислоты Res. 2019;47: Д607—Д613. пмид:30476243
  41. 41. Zhou Z, Dang Y, Zhou M, Li L, Yu C-H, Fu J и др. Использование кодонов является важной детерминантой уровней экспрессии генов, в основном благодаря их влиянию на транскрипцию. Proc Natl Acad Sci USA. 2016; 113: E6117—E6125. пмид:27671647
  42. 42. Мо Дж, Лян Х, Су С, Ли П, Чен Дж, Чжан Б.DDX3X: структура, физиологические функции и рак. Мол Рак. Биомед Центральный; 2021;20:38. pmid:33627125
  43. 43. Сото-Рифо Р., Олманн Т. Роль РНК-геликазы DEAD-box DDX3 в метаболизме мРНК. Wiley Interdiscip Rev RNA. Wiley Interdiscip Rev RNA; 2013;4: 369–385. пмид:23606618
  44. 44. Бьюкен Дж.Р. гранулы мРНП. Сборка, функция и связь с болезнью. РНК биол. 2014;11: 1019–1030. пмид:25531407
  45. 45. Чирилло Л., Кирен А., Барбьери С., Конг А., Швагер Ф., Паркер Р. и др.UBAP2L образует отдельные ядра, которые участвуют в зародышеобразовании стрессовых гранул выше по течению от G3BP1. Карр Биол. 2020;30: 698—707.e6. пмид:31956030
  46. 46. Yang W, Ru Y, Ren J, Bai J, Wei J, Fu S и др. G3BP1 ингибирует репликацию РНК-вируса, положительно регулируя опосредованный RIG-I клеточный противовирусный ответ. Клеточная смерть Дис. 2019;10: 946. pmid:31827077
  47. 47. Мюллер-Макниколл М., Нойгебауэр К.М. Как клетки получают сообщение: динамическая сборка и функция комплексов мРНК-белок.Нат Рев Жене. 2013; 14: 275–287. пмид: 23478349
  48. 48. Каменска А., Симпсон С., Виндри С., Брумхед Х., Бенар М., Эрноулт-Ланж М. и др. Взаимодействие DDX6-4E-T опосредует репрессию трансляции и сборку P-тела. Нуклеиновые Кислоты Res. 24.06.2016. Издательство Оксфордского университета; 2016; 44: 6318–6334. пмид:27342281
  49. 49. Guenther UP, Weinberg DE, Zubradt MM, Tedeschi FA, Stawicki BN, Zagore LL, et al. Хеликаза Ded1p контролирует использование почти родственных кодонов инициации трансляции в 5′-UTR.Природа. 2018; 559: 130–134. пмид: 29950728
  50. 50. Soto-Rifo R, Rubilar PS, Limousin T, de Breyne S, Décimo D, Ohlmann T. Белок DEAD-box DDX3 связывается с eIF4F, чтобы способствовать трансляции выбранных мРНК. EMBO J. 2012; 31: 3745–3756. пмид:22872150
  51. 51. Сен Н.Д., Чжоу Ф., Инголия Н.Т., Хиннебуш А.Г. Полногеномный анализ эффективности трансляции выявил различные, но перекрывающиеся функции дрожжевых DEAD-box хеликаз РНК Ded1 и eIF4A. Геном Res. 2015; 25: 1196–205.пмид:26122911
  52. 52. Кальвиелло Л., Венкатараманан С., Роговски К.Дж., Уайлер Э., Уилкинс К., Теджура М. и др. Истощение DDX3 подавляет трансляцию мРНК со сложными 5′-UTR. Нуклеиновые Кислоты Res. 2021; 49: 5336–5350. пмид:336
  53. 53. Гонг С., Крупка Дж. А., Гао Дж., Григоропулос Н. Ф., Гиотопулос Г., Асби Р. и соавт. Последовательная обратная дисрегуляция хеликаз РНК DDX3X и DDX3Y способствует лимфомагенезу, управляемому MYC. Мол Ячейка. Соединенные Штаты; 2021; 81: 4059–4075.е11. пмид:34437837
  54. 54. Де Гауденци Дж.Г., Ягер А.В., Изкович Р., Кампо В.А. Взгляд на регуляцию процессинга мРНК полицистронных транскриптов, опосредованного DRBD4/PTB2, трипаносомным гомологом белка, связывающего полипиримидиновый тракт. Дж Эукариот микробиол. 2016; 63: 440–452. пмид: 26663092
  55. 55. Чен Т-М, Лай М-К, Ли Ю-Х, Чан Ю-Л, Ву Ч-Х, Ван Ю-М и др. hnRNPM индуцирует переключение трансляции при гипоксии, что способствует развитию рака толстой кишки. ЭБиоМедицина.2019; 41: 299–309. пмид:30852162
  56. 56. Маслон М.М., Эрас С.Р., Беллора Н., Эйрас Э., Касерес Дж.Ф. Трансляционный ландшафт фактора сплайсинга SRSF1 и его роль в митозе. Элиф. eLife Sciences Publications Ltd; 2014;2014. пмид:24842991
  57. 57. Kim J, Park RY, Chen JK, Kim J, Jeong S, Ohn T. Фактор сплайсинга SRSF3 подавляет трансляцию мРНК запрограммированной гибели клеток 4, связываясь с областью 5′-UTR. Смерть клеток Издательская группа «Природа»; 2014; 21: 481–490.пмид: 24292556
  58. 58. Guo W, Schafer S, Greaser ML, Radke MH, Liss M, Govindarajan T, et al. RBM20, ген наследственной кардиомиопатии, регулирует сплайсинг тайтина. Нат Мед. 2012; 18: 766–773. пмид:22466703
  59. 59. Рэй Д., Казан Х., Кук К.Б., Вейраух М.Т., Наджафабади Х.С., Ли Х и др. Сборник РНК-связывающих мотивов для расшифровки регуляции генов. Природа. 2013; 499: 172–177. пмид:23846655
  60. 60. Мацуки Х., Такахаши М., Хигучи М., Макоха Г.Н., Ойе М., Фуджи М.И G3BP1, и G3BP2 способствуют образованию стрессовых гранул. Гены в клетки. Джон Уайли и сыновья, ООО; 2013; 18: 135–146. пмид:23279204
  61. 61. Ин С, Хаперский Д.А. УФ-повреждение индуцирует G3BP1-зависимое образование стрессовых гранул, которое не обусловлено остановкой трансляции, опосредованной ингибированием mTOR. Дж. Клеточные науки. ООО «Компания Биологов»; 2021;133. пмид:32989041
  62. 62. Sahoo PK, Lee SJ, Jaiswal PB, Alber S, Kar AN, Miller-Randolph S, et al. Аксональный белок стрессовых гранул G3BP1 ограничивает трансляцию аксональной мРНК и регенерацию нервов.Нац коммун. 2018;9: 3358. pmid:30135423
  63. 63. Дун Г., Лян Ф., Сунь Б., Ван С., Лю И., Гуань Х. и др. Наличие и функция стрессовых гранул при мерцательной аритмии. ПЛОС Один. Публичная научная библиотека; 2019;14. пмид:30943206
  64. 64. Коста М., Охем А., Штауб А., Фаласки А. ДНК-хеликаза человека VIII: ДНК- и РНК-хеликаза, соответствующая белку G3BP, элементу пути трансдукции Ras. Нуклеиновые Кислоты Res. 1999 г.; пмид:9889278
  65. 65.Фишер Дж.В., Буса В.Ф., Шао Ю., Леунг А.К.Л. Структурно-опосредованный распад РНК под действием UPF1 и G3BP1. Мол Ячейка. Сотовый Пресс; 2020;78: 70–84.e6. пмид:32017897
  66. 66. Лавер Д.Д., Ли Дж., Винн А.К., Анже С., Смиберт К.А., Липшиц Х.Д. РНК-связывающий белок Rasputin/G3BP повышает стабильность и трансляцию его мРНК-мишеней. CellReports. 2020;30: 3353–3367.e7. пмид:32160542
  67. 67. Йедавалли ВСРК, Невё К., Чи Ю.Х., Клейман Л., Жанг К.Т. Потребность в хеликазе бокс-РНК DDX3 DEAD для экспортной функции HIV-1 Rev-RRE.Клетка. Соединенные Штаты; 2004; 119: 381–392. пмид:15507209
  68. 68. Шен Л., Пеллетье Дж. Общие и целевые РНК-геликазы DExD/H в инициации трансляции у эукариот. Int J Mol Sci. 2020;21. пмид:32575790
  69. 69. Хилликер А., Гао З., Янковски Э., Паркер Р. Белок DEAD-Box Ded1 модулирует трансляцию путем образования и разрешения комплекса eIF4F-мРНК. Мол Ячейка. 2011; 43: 962–972. пмид:21925384
  70. 70. Малинова А., Цвачкова З., Матей Д., Горжейши З., Абеза С., Вандерморе Ф. и др.Сборка компонента U5 snRNP PRPF8 контролируется шаперонами HSP90/R2TP. Джей Селл Биол. 2017; 216: 1579–1596. пмид: 28515276
  71. 71. Фабрицио П., Лаггербауэр Б., Лаубер Дж., Лейн В.С., Люрманн Р. Эволюционно консервативный sRNP-специфический белок U5 представляет собой GTP-связывающий фактор, тесно связанный с рибосомной транслоказой EF-2. EMBO J. 1997; 16: 4092–4106. пмид:9233818
  72. 72. Yao T, Song L, Jin J, Cai Y, Takahashi H, Swanson SK и др. Различные способы регуляции деубиквитинирующего фермента Uch47 в протеасоме и в комплексе ремоделирования хроматина Ino80.Мол Ячейка. Мол Ячейка; 2008; 31: 909–917. пмид:18922472
  73. 73. Copsey AC, Cooper S, Parker R, Lineham E, Lapworth C, Jallad D, et al. Хеликаза, DDX3X, взаимодействует с поли(А)-связывающим белком 1 (РАВР1) и каприном-1 на переднем крае мигрирующих фибробластов и необходима для эффективного распространения клеток. Биохим Дж. 2017; 474: 3109–3120. пмид:28733330
  74. 74. Дамианов А., Ин Ю., Лин Ч.-Х., Ли Дж.-А., Тран Д., Вашишт А.А. и др. Белки Rbfox регулируют сплайсинг как часть большого мультибелкового комплекса LASR.Клетка. 2016; 165: 606–619. пмид:27104978
  75. 75. Kim Y, Myong S. Активность ремоделирования РНК белков DEAD Box, регулируемая концентрацией белка, длиной РНК и АТФ. Мол Ячейка. 2016; 63: 865–876. пмид:27546789
  76. 76. Берджесс Х.М., Ричардсон В.А., Андерсон Р.К., Салаун С., Грэм С.В., Грей Н.К. Ядерная релокализация цитоплазматических поли(А)-связывающих белков PABP1 и PABP4 в ответ на УФ-облучение выявляет мРНК-зависимый экспорт PABP многоклеточных животных. Дж. Клеточные науки. 2011; 124: 3344–3355.пмид:21940797
  77. 77. Хэннон ГДж. Набор инструментов FASTX. [Интернет]. 2010. Доступно: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit
  78. 78. Добин А., Дэвис К.А., Шлезингер Ф., Дренков Дж., Залески С., Джа С. и соавт. STAR: Сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика. 2013; 29: 15–21. пмид:23104886
  79. 79. Андерс С., Пил П.Т., Хубер В. HTSeq — платформа Python для работы с высокопроизводительными данными секвенирования. Биоинформатика. Издательство Оксфордского университета; 2015; 31: 166–169.пмид:25260700
  80. 80. Лав М.И., Хубер В., Андерс С. Модерированная оценка изменения кратности и дисперсии для данных секвенирования РНК с помощью DESeq2. Геном биол. 2014;15: 550. pmid:25516281
  81. 81. Чжун Ю., Каралетсос Т., Древе П., Шридхаран В. Т., Куо Д., Сингх К. и др. RiboDiff: обнаружение изменений эффективности трансляции мРНК по следам рибосом. Биоинформатика. 2017; пмид:27634950
  82. 82. Куинлан А.Р., Холл И.М. BEDTools: гибкий набор утилит для сравнения геномных признаков.Биоинформатика. 2010; 26: 841–842. пмид:20110278
  83. 83. Ли Кью, Браун Дж.Б., Хуан Х., Бикель П.Дж. Измерение воспроизводимости высокопроизводительных экспериментов. Энн Appl Стат. 2011;5: 1752–1779.
  84. 84. Бенджамини Ю., Хохберг Ю. Контроль частоты ложных открытий: практичный и мощный подход к множественному тестированию. JR Stat Soc Ser B. 1995;57.
  85. 85. Консорциум GTEx. Проект экспрессии генотипа ткани (GTEx). Нат Жене. 2013; 45: 580–585.пмид:23715323
  86. 86. Шафер С., Миао К., Бенсон С.С., Хейниг М., Кук С.А., Хабнер Н. Сигнатуры альтернативного сплайсинга в данных РНК-сек: процент сплайсинга в (PSI). Curr Protoc Hum Genet. 2015;87: 16.11.1–16.11.14. пмид: 26439713
  87. 87. Раудвере У., Колберг Л., Кузьмин И., Арак Т., Адлер П., Петерсон Х. и др. g: Profiler: веб-сервер для анализа функционального обогащения и преобразования списков генов (обновление 2019 г.). Нуклеиновые Кислоты Res. 2019; 47: Ж191–Ж198. пмид:31066453
  88. 88.Лоренц Р., Бернхарт С.Х., Хёнер цу Зидердиссен С., Тафер Х., Фламм С., Штадлер П.Ф. и др. Пакет ViennaRNA 2.0. Алгоритмы мол. биол. 2011;6: 26. pmid:22115189
  89. 89. Основная команда разработчиков R. R: язык и среда для статистических вычислений. [Интернет]. 2016.

Ученые создают многофункциональные белково-полимерные пленки

Молекула дендримера отмечена желтым цветом. Поверхность белковой молекулы имеет цветовую кодировку в соответствии с химическими свойствами аминокислотных остатков (красный — положительный заряд, синий — отрицательный заряд, зеленый — поляризованный, белый — гидрофобный).Кредит: Владимир Муронец

Группа ученых из МГУ совместно с зарубежными и российскими коллегами обнаружила, что при смешивании дендримеров (древовидных полимеров) и белков образуются спонтанные многослойные пленки. Они легко образуются и сохраняют активность и функцию белковых ферментов, что определяет их потенциал как материала для создания биосенсоров и изделий медицинского назначения. Результаты исследования опубликованы в журнале Polymer .

Полимеры имеют различную структуру, состав и свойства.Дендримеры представляют собой многократно разветвленные молекулы с тремя химическими группами, прикрепленными к центральному ядру, каждая из которых разветвляется на группы с одинаковой структурой. Этот полимер разработан с помощью многостадийного синтеза.

Количество точек ветвления определяет номер поколения дендримера: полимер первого поколения имеет одну точку ветвления, второго — две, третьего — три и так далее. Чем дальше, тем плотнее и сферичнее становится структура, а ее физико-химические свойства задаются функциональными группами внешнего слоя.Дендримеры способны образовывать поверхностные полости, в которые могут быть заключены молекулы, что интересует исследователей. Однако ученые МГУ нашли дендримерам совсем другое применение.

«Нами установлено, что при смешивании белков с дендримерами четвертого поколения происходит самосборка многослойных нанопленок толщиной 200-700 нм. Они могут прилегать к стеклянным или пластиковым поверхностям, а также образовываться на границе раздела жидкость-воздух. , — говорит исследователь Владимир Муронец.

Ученые провели эксперименты по включению в состав нанопленок ферментов — лизоцима, разрушающего клеточные стенки бактерий, и нескольких видов протеиназ, расщепляющих белки.Исследователи пришли к выводу, что в составе нанопленок эти белки способны сохранять активность около двух недель. Эта двухкомпонентная система устойчива к действию моющих средств и изменению кислотности среды, в целом стабильна при хранении. Однако основным преимуществом производимых пленок является простота их синтеза, основанная на самосборке.

«Мы считаем, что белково-дендримерные пленки являются перспективными материалами для создания биосенсоров, а также могут быть использованы в медицине в качестве биоактивного перевязочного материала», — заключает Владимир Муронец.


Обнаружение паров растворителя невооруженным глазом
Дополнительная информация: Юлия Стройлова и др., Спонтанное образование нанопленок при взаимодействии пиридилфениленового дендримера 4-го поколения с белками, Polymer (2018).DOI: 10.1016/j.polymer.2018.01.015 Предоставлено Московский государственный университет имени Ломоносова

Цитата : Ученые создают многофункциональные белково-полимерные пленки (2018, 6 марта) получено 13 апреля 2022 г. с https://физ.org/news/2018-03-scientists-multifunctional-protein-polymer.html

Этот документ защищен авторским правом. Помимо любой добросовестной сделки с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в ознакомительных целях.

Ученые создали многофункциональный протеин-по | Eurekalert!

Изображение

: молекула дендримера отмечена желтым цветом.Поверхность белковой молекулы имеет цветовую кодировку в соответствии с химическими свойствами аминокислотных остатков (красный — положительный заряд, синий — отрицательный заряд, зеленый — поляризованный, белый — гидрофобный). Изображение было опубликовано в соответствующей статье . посмотреть больше 

Кредит: Владимир Муронец

Группа из МГУ совместно с зарубежными и российскими коллегами установила, что при смешении дендримеров (древовидных полимеров) и белков спонтанно образуются многослойные пленки.Они легко образуются и сохраняют активность и функцию белковых ферментов, что определяет их потенциал как материала для создания биосенсоров и изделий медицинского назначения. Результаты исследования опубликованы в журнале Polymer .

На сегодняшний день известно огромное количество полимеров различной структуры, состава и свойств. Одним из наиболее интересных примеров являются дендримеры — древовидные макромолекулы. Устроены они следующим образом: к центральному стержню прикрепляются три химические группы, каждая из которых разветвляется на две такие же группы, и так далее, и так далее.Такая структура достигается многостадийным синтезом.

Количество точек ветвления определяет номер поколения дендримера: полимер первого поколения имеет одну точку ветвления, второго – две, третьего – три и так далее. Чем дальше, тем плотнее и сферичнее становится структура, а ее физико-химические свойства задаются функциональными группами внешнего слоя. Дендримеры способны образовывать поверхностные полости, в которые могут быть заключены молекулы, и это свойство явилось главной предпосылкой активного изучения этих полимеров.Однако ученые МГУ нашли дендримерам совсем другое применение.

«Обнаружено, что при смешивании белков с дендримерами четвертого поколения происходит самосборка многослойных нанопленок толщиной 200-700 нм. Они могут прилегать к стеклянным или пластиковым поверхностям, а также образовываться на границе раздела жидкость-воздух,» — говорит Владимир Муронец, профессор факультета биоинженерии и биоинформатики и биологического факультета МГУ, заведующий кафедрой биохимии клеток животных Института им.Институт физико-химической биологии им. Н. Белозерского МГУ.

Ученые провели эксперименты по включению в состав нанопленок различных ферментов: лизоцима, разрушающего клеточные стенки бактерий, и нескольких видов протеиназ, расщепляющих белки. Сделан вывод, что в составе нанопленок эти белки способны сохранять активность около двух недель. Эта двухкомпонентная система устойчива к действию чистящих средств (моющих средств), к изменению кислотности среды, в целом стабильна при хранении.Однако основным преимуществом производимых пленок является простота процесса их формирования за счет самосборки.

«Мы считаем, что белково-дендримерные пленки являются перспективными материалами для создания биосенсоров, а также могут быть использованы в медицине в качестве биоактивного перевязочного материала», — заключает Владимир Муронец.

Работа выполнена совместно с учеными Первого МГМУ им. И.М. Сеченова; Несмеянова РАН; Зелинского РАН и Французского национального института сельскохозяйственных исследований.